Gerüstgestützte Transplantation von Inseln in der epididymalen Fettauflage von diabetischen Mäusen
Summary
Dieses Protokoll zeigt die Mäuseinselisolation und die Aussaat auf ein dezelluläres Gerüst. Gerüstunterstützte Inselchen wurden in das epididymale Fettpolster von Streptozotocin (STZ) -induzierten diabetischen Mäusen transplantiert. Islets überlebten an der Transplantationsstelle und umkehrten den hyperglykämischen Zustand.
Abstract
Die Islet-Transplantation wurde klinisch als wirksam bei der Behandlung von Typ-1-Diabetes erwiesen. Allerdings kann die aktuelle intrahepatische Transplantationsstrategie akute Vollblutreaktionen hervorrufen und zu einer schlechten Inselentransplantation führen. Hier berichten wir über ein robustes Protokoll zur Transplantation von Inselchen an der extrahepatischen Transplantationsstelle – dem epididymalen Fettpolster (EFP) – bei einem diabetischen Mausmodell. Ein Protokoll zur Isolierung und Reinigung von Inselchen mit hohen Ausbeuten von C57BL / 6J-Mäusen wird beschrieben, sowie ein Transplantationsverfahren, das durch Seeding-Inseln auf ein dezelluläres Gerüst (DCS) durchgeführt wird und sie an der EFP-Stelle in syngenen C57BL / 6J-Mäusen, die Diabetiker übertragen werden, implantiert Durch Streptozotocin. Das DCS-Transplantat, das 500 Inseln enthält, hat den hyperglykämischen Zustand innerhalb von 10 Tagen umgekehrt, während die freien Inseln ohne DCS mindestens 30 Tage benötigt werden. Die Normoglykämie wurde bis zu 3 Monate aufrechterhalten, bis das Transplantat explantiert wurde. Abschließend erhöhte DCS die Einlagerung von Inselchen in tDie extrahepatische Stelle des EFP, die leicht abgerufen werden könnte und eine reproduzierbare und nützliche Plattform für die Untersuchung der Gerüstmaterialien sowie andere Transplantationsparameter für eine erfolgreiche Insert-Engagement zur Verfügung stellen könnte.
Introduction
Typ 1 Diabetes mellitus (T1D) ist eine autoimmune endokrine Störung, in der Inselzellen durch das Immunsystem ablatiert werden, wodurch Patienten abhängig von der Injektion von exogenem Insulin für ihr ganzes Leben sind. Das Edmonton-Protokoll stellt einen Meilenstein in klinischen Studien der Inselentransplantation dar; Inselchen wurden durch die Pfortader infundiert und an der intrahepatischen Stelle transplantiert 1 . Doch zwei Haupthindernisse – unzureichende Quellen von Spenderinseln und schlechte Inselentransplantation – verhindern den breiten Erfolg der Inselentransplantation 2 . Normalerweise müssen Inselchen von drei kadaverischen Spendern gesammelt werden, um den hyperglykämischen Zustand eines Patienten umzukehren; Dies ist auf die geringe Ausbeute an Islet-Isolationsverfahren und den Inselverlust nach der Transplantation zurückzuführen. Insbesondere, obwohl die Nachtransplantationsinseln in sauerstoffreichem Blut gebadet wurden, zeigte der direkte Kontakt mit dem Blut oft das augenblicklich blutvermittelte Entzündungsmittel(IBMIR), die den akuten Verlust der Inselchen verursachen könnten. Langfristig wird angenommen, dass der allmähliche Verlust von Inselchen bei Patienten für den Tropfen der Diabetes-Umkehrraten in den klinischen Gruppen verantwortlich war, die im ersten Jahr 90% erreichen konnten und auf 30% und 10% um 2 und 5 sanken Jahre nach der Transplantation bzw. 3 .
Die Islet-Transplantation an extrahepatischen Stätten war eine attraktive Strategie, um den direkten Kontakt von Inselchen mit Blut zu reduzieren und die Transplantationen im Vergleich zur intrahepatischen Infusion an definierbare Stellen zu beschränken. In den Nierenkapseln, Augen, Muskeln, Fettpolstern und subkutanen Räumen wurden in den vergangenen Jahren Untersuchungen durchgeführt, die zeigen, dass Inselchen an diesen Standorten in der Lage sind, zu überleben und zu funktionieren, um die Normoglykämie wiederherzustellen 4 . Darüber hinaus sind die Inselchen an diesen Standorten abrufbar, was eine Biopsie oder sogar für weitere Ersatzverfahren ermöglicht. Extrahepatische sDaher zeigen sie ein großes Potential für die klinische Transplantation 5 .
Biomaterialbasierte Gerüste wurden intensiv für Zelltransplantation und Tissue Engineering untersucht. Dreidimensionale (3D) Gerüste enthalten in der Regel poröse Strukturen und können als zelluläre Schablonen dienen, um räumliche Struktur / Organisation von Zellen oder als Reservoirs zu erzeugen, um die kontrollierte Freisetzung von bioaktiven Cues zu ermöglichen. Gerüste wurden auch aus polymeren Materialien wie Poly (glycolid-L-lactid) 6 , Poly (dimethylsiloxan) 7 und thermoplastischem Poly (urethan) 8 hergestellt , um Inselchen im EFP zu transplantieren. Im Vergleich zur direkten Transplantation von Inselchen wurde festgestellt, dass die Verwendung von Gerüsten den Islet-Verlust verringert, indem das Auslaufen von Inselchen in den intraperitonealen Hohlraum 9 , 10 verhindert wird , was mechanischen Schutz und modu bereitstelltDie lokale entzündliche Reaktion. Die Gerüste können so entwickelt werden, um die Inselentransplantation an den Transplantationsstellen zu fördern 7 .
In dieser Studie beabsichtigen wir, ein Paradigma der Inselentransplantation im EFP zu demonstrieren, das in Mäusemodellen mit einem DCS durchgeführt wird. Gerüste aus extrazellulären Matrizen haben in den letzten Jahren großes Interesse an der überlegenen Biokompatibilität und natürlicheren porösen Strukturen im Vergleich zu synthetischen Produkten. Hier beschreiben wir ein robustes Isolationsprotokoll, um Pankreasinseln mit hohen Ausbeuten von C57BL / 6J-Mäusen zu erhalten. DCSs, die aus dem Rinderpericardium verarbeitet wurden, wurden dann mit Eseln ausgesät und die Transplantate wurden in syngene diabetische Modelle in die EFP transplantiert. Die Normoglykämie bei Mäusen wurde innerhalb von 10 Tagen erreicht und bis zu 100 Tage bis zur Entfernung der Transplantate aufrechterhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pankreas-Perfusion und Verdauungszeit sind zwei Schlüsselparameter, die die Ertragsausbeute und -qualität beeinflussen. Moskalewski berichtete zuerst über die Verwendung einer rohen Kollagenase-Mischung, um gehackte Meerschweinchen-Pankreas zu verdauen 11 . Lacy et al. die Injektion von Enzymen in das Kanalsystem berichtet , die Bauchspeicheldrüse perfundieren, die die Insel Ausbeute 12 stark erhöht. Die duktale Perfusion des Enzyms ermöglicht die maximale E…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Wei Zhang von Guanhao Biotech für die Bereitstellung der dezellularen Gerüste. Wir danken Xiao-hong Peng für die hilfreichen Diskussionen. Diese Forschung wurde finanziell unterstützt von der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung von China (Projekt Nr.31322021).
Materials
| Dissecting scissor | Ningbo Medical | ||
| Forceps | Ningbo Medical | ||
| 0.5 mm diameter wire mesh | Ningbo Medical | ||
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Artery hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
| Microscopic hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
| Hemostatic forceps | Ningbo Medical | ||
| Absorbable 6-0 PGLA sutures | JINHUAN | With needle | |
| Wound clip | Ningbo Medical | ||
| Cotton swab | Ningbo Medical | ||
| Gauze | Ningbo Medical | ||
| Sterile drapes | Ningbo Medical | ||
| 10mL syringe | JINGHUAN | ||
| 1 mL syringe | JINGHUAN | ||
| 27G intravenous needle | JINGHUAN | 0.45×15 RWSB | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Axygen | ||
| 15mL conical tube | Corning | 430791 | |
| 50mL conical tube | Corning | 430829 | |
| 35mm Non-treated Peri-dishes | Corning | 430588 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| 0.22 μm filter | Pall | PN4612 | |
| 10 mL serological pipet | Corning | 4488 | |
| Pipet filler S1 | Thermo Scientific | 9501 | |
| Pipette (2-20μL) | Axygen | AP-20 | AXYPETTM |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Hank’s balanced salt solution | Gibco | C14175500CP | |
| Collagenase P | Roche | COLLP-RO | |
| Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11879-20 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| D-glucose | Gibco | A24940-01 | |
| Glucose meter | Roche | ACCU-CHEK | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Streptozotocin | Sigma | V900890 | VetecTM |
| Chloral hydrate | J&K | C0073 | |
| Sodium citrate | Sigma | 71497 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Iodophors | Ningbo Medical | ||
| C57BL/6J, 10-12 weeks old | VitalRiver | Beijing, China | |
| Decellularized scaffold | Guanhao Biotec | 131102 | Guangzhou, China |
Referencias
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