Diyabetik Farenin Epididimal Yağ Tabağında Iskelelerin İskele Destekli Nakli
Summary
Bu protokol, murine iz izolasyonunu ve bir desellularize iskele üzerine tohumlamayı gösterir. İskele destekli adacıklar streptozotosin (STZ) ile indüklenen diyabetik farelerin epididimal yağ yastığı içine nakledildi. Isletler nakil alanından kurtuldu ve hiperglisemik durumu tersine çevirdi.
Abstract
Adacık transplantasyonunun klinik olarak tip 1 diyabet tedavisinde etkili olduğu kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, mevcut intrahepatik transplantasyon stratejisi akut tam kan reaksiyonlarına neden olabilir ve kötü adacık engraftmanına neden olabilir. Burada, ekstrahepatik transplantasyon alanındaki adacıkların transplantasyonu için sağlam bir protokol bildirdik, diyabetik bir fare modelinde epididimal yağ bandı (EFP). Adacıkların C57BL / 6J farelerden yüksek verimle izole edilmesi ve saflaştırılması için bir protokolün yanı sıra, bir desellüler hale getirilmiş iskelete (DCS) adacıkların ekilmesi ve diyabetik hale getirilen eş merkezli C57BL / 6J farelerindeki EFP alanına implante edilmesiyle gerçekleştirilen bir transplantasyon yöntemi anlatılmıştır Streptozotosin. DCS olmayan serbest adacıklar en az 30 gün süre ederken, 500 adacık içeren DCS grefti, hiperglisemik durumu 10 gün içinde tersine çevirdi. Normoglisemi, greft eksplantlana kadar 3 aya kadar sürdürüldü. Sonuç olarak, DCS adacıkların engraftsını tO ekstrahepatik EFP sitesinde bulunabilir ve bu iskelet materyallerini araştırmak için tekrarlanabilir ve yararlı bir platform sunabilir ve başarılı bir adacık yerleşimi için gereken diğer transplantasyon parametrelerini sağlayabilir.
Introduction
Tip 1 diabetes mellitus (T1D) adacık hücrelerinin bağışıklık sistemi tarafından ablasyona uğramış olduğu hastaları, tüm yaşamları boyunca eksojen insülin enjeksiyonuna bağımlı kılan bir otoimmün endokrin bozukluktur. Edmonton protokolü adacık transplantasyonunun klinik çalışmalarında bir kilometre taşı temsil eder; Adacıklar portal ven yoluyla infüze edildi ve intrahepatik bölgeye nakledildi 1 . Bununla birlikte, donör adacıklarının yetersiz kaynakları ve zayıf adacık engrafmanı olmak üzere iki ana engel, adacık transplantasyonunun geniş başarısını engellemektedir 2 . Genellikle, bir hastanın hiperglisemik durumunu tersine çevirmek için üç kadavradan donörden adacıklar toplanmalıdır; Bunun nedeni, düşük adacık yalıtım prosedürleri ve transplantasyondan sonraki adacık kaybıdır. Özellikle, transplantasyon sonrası adacıklar oksijen açısından zengin kanla ıslatılmış olsalar da, kanla doğrudan temas çoğu zaman kan yoluyla dolaştırılan inflamamayı uyandırırAdacıkların akut şekilde kaybedilmesine neden olabilecek toory reaction (IBMIR). Uzun vadede, hastalardaki adacıkların kademeli olarak kaybedilmesi, birinci yılda% 90'a ulaşabilen ve 2 ve 5 oranında% 30'a ve% 10'a düşebilecek klinik gruplarda diyabetin tersine dönme oranlarının düşmesine neden oldu- ğu düşünülmektedir Transplantasyon sonrası yıllar sırasıyla 3 .
Ekstrahepatik bölgelerdeki adacık transplantasyonu, adacıkların kanla doğrudan temasını azaltmak, intrahepatik infüzyona kıyasla transplantları daha tanımlanabilir yerlere kısıtlamak için çekici bir strateji olmuştur. Geçtiğimiz yıllar boyunca böbrek kapsülü, göz, kas, yağ yastıkları ve subkutanöz alanlarda çalışmalar yapıldı ve bu bölgelerdeki adacıkların normoglisemi 4'ü geri kazanmak için ayakta kalabildiklerini ve işlev gösterebildiklerini gösterdi. Buna ek olarak, bu bölgelerdeki adacıklar geri alınabilir, böylece biyopsi veya daha başka değiştirme prosedürleri mümkündür. Ekstrahepatik sBu nedenle, klinik transplantasyon için büyük bir potansiyel ortaya koymaktadır 5 .
Biyolojik materyal tabanlı iskeleler hücre nakli ve doku mühendisliği için yoğun şekilde araştırıldı. Üç boyutlu (3D) iskele genellikle gözenekli yapılar içerir ve hücrelerin mekansal yapısını / organizasyonunu oluşturmak için hücresel şablonlar olarak veya biyoaktif ipuçlarının kontrollü salımını sağlamak için rezervuar olarak işlev görebilir. İskele ayrıca EFP'deki adacıkları nakletmek için poli (glikolid-L-laktit) 6 , poli (dimetilsiloksan) 7 ve termoplastik poli (üretan) 8 gibi polimerik malzemelerden imal edilmiştir. Adacıkların doğrudan transplantasyonu ile karşılaştırıldığında, iskeletlerin adacıkların intraperitoneal boşluğa 9 , 10 sızıntısını önleyerek adacık kaybını azalttığı ve mekanik korumanın sağlandığı ve modülLokal inflamatuar reaksiyonu önleme. İskele böylece, transplantasyon bölgelerinde 7 adacık engraftmanını geliştirmek için geliştirilebilir.
Bu çalışmada, bir DCS kullanarak farelerin modellerinde gerçekleştirilen, EFP'deki adacık nakli paradigmasını göstermek istiyoruz. Ekstraselüler matristen türetilen iskeleler, sentetik ürünlerle karşılaştırıldığında üstün biyouyumluluk ve daha doğal gözenekli yapılar nedeniyle son yıllarda büyük ilgi gördü. Burada, C57BL / 6J farelerden yüksek verimle pankreatik adacıklar elde etmek için sağlam bir izolasyon protokolü açıklanmaktadır. Sığır perikardından işlenen DCS'lere daha sonra adacıklar ekildi ve greftler, eşzamanlı diyabetik modellerde EFP'ye nakledildi. Farelerde normoglisemi, 10 gün içinde elde edildi ve greftlerin çıkarılıncaya kadar 100 güne kadar tutuldu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pankreas perfüzyonu ve sindirim zamanı, adacık verimi ve kalitesini etkileyen iki önemli parametredir. Moskalewski ilk olarak kıyılmış kobay pankreasını 11 sindirmek için ham kollajenaz karışımı kullanımını bildirdi. Lacy ve ark. , Adacık verimi 12'yi büyük ölçüde arttıran pankreaları perfüze için kanal sistemine enzim enjeksiyonu yaptığını bildirdi. Enzim duktal perfüzyon daha homojen bir sindirim ve pankreas <sup class="xref"…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, decellularized iskeleler sağlamaktan Guanhao Biotech'ten Wei Zhang'a teşekkür etmek istiyorlar. Yardımcı tartışmalar için Xiao-hong Peng'e teşekkür ediyoruz. Bu araştırma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı tarafından maddi olarak desteklendi (Proje No: 31322021).
Materials
| Dissecting scissor | Ningbo Medical | ||
| Forceps | Ningbo Medical | ||
| 0.5 mm diameter wire mesh | Ningbo Medical | ||
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Artery hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
| Microscopic hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
| Hemostatic forceps | Ningbo Medical | ||
| Absorbable 6-0 PGLA sutures | JINHUAN | With needle | |
| Wound clip | Ningbo Medical | ||
| Cotton swab | Ningbo Medical | ||
| Gauze | Ningbo Medical | ||
| Sterile drapes | Ningbo Medical | ||
| 10mL syringe | JINGHUAN | ||
| 1 mL syringe | JINGHUAN | ||
| 27G intravenous needle | JINGHUAN | 0.45×15 RWSB | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Axygen | ||
| 15mL conical tube | Corning | 430791 | |
| 50mL conical tube | Corning | 430829 | |
| 35mm Non-treated Peri-dishes | Corning | 430588 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| 0.22 μm filter | Pall | PN4612 | |
| 10 mL serological pipet | Corning | 4488 | |
| Pipet filler S1 | Thermo Scientific | 9501 | |
| Pipette (2-20μL) | Axygen | AP-20 | AXYPETTM |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Hank’s balanced salt solution | Gibco | C14175500CP | |
| Collagenase P | Roche | COLLP-RO | |
| Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11879-20 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| D-glucose | Gibco | A24940-01 | |
| Glucose meter | Roche | ACCU-CHEK | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Streptozotocin | Sigma | V900890 | VetecTM |
| Chloral hydrate | J&K | C0073 | |
| Sodium citrate | Sigma | 71497 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Iodophors | Ningbo Medical | ||
| C57BL/6J, 10-12 weeks old | VitalRiver | Beijing, China | |
| Decellularized scaffold | Guanhao Biotec | 131102 | Guangzhou, China |
Referencias
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Shapiro, A. M. J., et al. International Trial of the Edmonton Protocol for Islet Transplantation. N Engl J Med. 355, 1318-1330 (2006).
- Ryan, E. A., et al. Five-year follow-up after clinical islet transplantation. Diabetes. 54, 2060-2069 (2005).
- Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. Br J Surg. 95, 1449-1461 (2008).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nat Biotechnol. 35 (1), (2017).
- Dufour, J. M., et al. Development of an ectopic site for islet transplantation, using biodegradable scaffolds. Tissue Eng. 11, 1323-1331 (2005).
- Weaver, J. D., et al. Controlled Release of Dexamethasone from Organosilicone Constructs for Local Modulation of Inflammation in Islet Transplantation. Tissue Eng Part A. 21, 2250-2261 (2015).
- Wang, K., et al. From Micro to Macro: The Hierarchical Design in a Micropatterned Scaffold for Cell Assembling and Transplantation. Adv Mater. 29, (2017).
- Blomeier, H., et al. Polymer Scaffolds as Synthetic Microenvironments for Extrahepatic Islet Transplantation. Transplantation. 82, 452-459 (2006).
- Gibly, R. F., et al. Extrahepatic islet transplantation with microporous polymer scaffolds in syngeneic mouse and allogeneic porcine models. Biomaterials. 32, 9677-9684 (2011).
- Moskalewski, S. Isolation and Culture of the Islets of Langerhans of the Guinea Pig. Gen Comp Endocrinol. 5, 342-353 (1965).
- Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16, 35-39 (1967).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation. J Vis Exp. (50), (2011).
- Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nat Protoc. 4, 1649-1652 (2009).
- Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease. J Vis Exp. (67), (2012).
- Sakata, N., Yoshimatsu, G., Tsuchiya, H., Egawa, S., Unno, M. Animal models of diabetes mellitus for islet transplantation. Exp Diabetes Res. , 256707 (2012).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nat Biotech. 35, 8-8 (2017).
- Londono, R., Badylak, S. F. Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling. Ann Biomed Eng. 43, 577-592 (2015).
