Sintonizável hidrogéis a partir de Pulmonar Matriz Extracelular para Cultura Celular 3D

Summary

Este é um método para criar uma estrutura de suporte de cultura de células 3-dimensional a partir da matriz extracelular pulmonar. pulmão intacto é transformado em hidrogéis que podem suportar o crescimento das células em três dimensões.

Abstract

Aqui é apresentado um método para o estabelecimento de múltiplos componentes hidrogéis de cultura de células para a cultura de células em pulmão in vitro. Começando com saudável en bloc tecido pulmonar de porcino, rato ou ratinho, o tecido é submergido perfundidos e em detergentes químicas subsequentes para remover os detritos celulares. Comparação histológica do tecido antes e depois do processamento confirma a remoção de mais de 95% de ADN de cadeia dupla coloração e alfa-galactosidase sugere a maioria dos detritos celulares são removidos. Após a descelularização, o tecido é, em seguida, liofilizado e cryomilled em um pó. O pó de matriz é digerido durante 48 horas numa solução de pepsina a digestão ácida e, em seguida, neutralizou-se para formar a solução Pregel. A gelificação da solução Pregel pode ser induzida através da incubação a 37 ° C e pode ser utilizada imediatamente após a neutralização ou armazenado a 4 ° C durante até duas semanas. Os revestimentos podem ser formados utilizando a solução Pregel sobre uma chapa não tratada para Capego ell. As células podem ser suspensas no Pregel antes de auto-montagem para alcançar uma cultura 3D, plaqueadas sobre a superfície de um gel formado a partir do qual as células podem migrar através do andaime, ou revestida sobre os revestimentos. Alterações à estratégia apresentada pode ter impacto na temperatura de gelificação, força ou tamanhos dos fragmentos de proteína. Além formação de hidrogel, o hidrogel de rigidez pode ser aumentada usando genipina.

Introduction

Translating in vitro results to the clinic is one of the most challenging issues facing biomedical researchers. In vitro research on tissue culture plastic is easier, more convenient, and maintains high cell viability.¹ This approach is a reasonable starting point, but the results have limited clinical translation. Increasingly, laboratories are incorporating three-dimensional constructs to replace the traditional two-dimensional methods. Reviews are available for many three-dimensional environments, from biological scaffolds to polymeric scaffolds.^2,3

Biological frameworks can mimic characteristics of in vivo environments as they contain many of the protein and glycosaminoglycan components of the native matrix and provide familiar binding sites for cells to attach to and recognize. Extracellular matrix (ECM) derived materials have been shown to be capable scaffolds for cell attachment and proliferation.⁴ One challenge that limits the application of ECM hydrogel platforms stems from their inherently weak mechanical properties following gelation. Native tissue often has mechanical properties that are magnitudes higher than hydrogels. Non-toxic crosslinking agents can increase the mechanical properties of hydrogels to better mimic the native tissue environment. Genipin is a non-toxic, natural crosslinker derived from Gardenia plants with the ability to closely tailor mechanical properties of ECM with changes in genipin concentration^5,6.

Nearly all cells in the body exist in, and organize on, ECM that they either produce or maintain. New focus on the universal importance of ECM in the organization, condition, and function in every organ or system has sparked the production of matrix based platforms for in vitro investigation. Porcine small intestine submucosa is the most extensively studied naturally-derived scaffold, and it has been used to regenerate tendons, ligaments, skeletal muscle⁴, and even bone⁷. Matrices from other organs and donor species have also demonstrated good tissue regeneration potential. The use of foreign ECM components causes minimal issues with immunomodulation. After elimination of host cellular matter, the remaining ECM will be similar in amino acid content and organization to all other mammalian species⁸. There is a growing line of thinking that the best way to examine cell-ECM interactions in vitro is to utilize organ-specific ECM scaffolds. Each organ provides a unique composition of proteins and proteoglycans to create cellular niches. Niches provide structural, functional and even the enzymatic breakdown of the extracellular matrix contributing to biophysical signaling. To attain an in vitro microenvironment most similar to the in vivo microenvironment, use of tissue specific ECM would optimize the cellular niches for research.

The goal of this protocol is to provide a method for establishing a hydrogel scaffold unique to the lung ECM. This method provides a platform for in vitro research on lung cell-ECM interactions.

Protocol

Solução filtro esterilizado Instruções 2 O DIH sim DIH 2 O; esterilizada por filtração 0,1% de solução de Triton X-100 sim Sob hotte adicionar 100 uL de Triton X-100 a 100 ml solução DIH 2 O e agitar até à dissolução; filtro esterilizado. </…

Representative Results

Usando este método, temos produzido a partir de hidrogéis de porco normal, rato, e pulmões de ratinho (Figura 1). pulmões transformados fornecer um valor estimado de 5 mg, 40 mg, e 10 g de ECM em pó respectivamente. Uma visão geral do processo é mostrado na Figura 2. visualizações chave durante o processo incluem: aparência branca dos pulmões após a lavagem desoxicolato; após a formação Pregel, a solução deve ser opaco e a solução deve…

Discussion

Um dos aspectos integrais da biologia é a auto-organização das moléculas em estruturas hierárquicas que executam uma tarefa específica. ¹³ No laboratório, a auto-montagem depende de numerosos factores tais como a concentração de sal, pH, e a duração de digestão. Como mostrado, uma auto-organização de formas de hidrogel quando as proteínas solubilizadas retornar a uma temperatura fisiológica. O hidrogel formado é capaz de promover a adesão celular e a proliferação in vitro.

<p …

Materials

Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100	Use in fume hood with eye protection and gloves.
Sodium Deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750-100g	Use with eye protection and gloves.
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M7506-500g	None
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C1016-500g	None
DNase	Sigma-Aldrich	D5025-150KU	None
HCl	Sigma-Aldrich	258148-500ML	Use with eye protection and gloves.
Pepsin	Sigma-Aldrich	P6887-5G	Use in fume hood with eye protection and gloves.
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	BP359-500	Use with eye protection and gloves.
Genipin	Wako Chemicals	078-03021	Use in fume hood with eye protection and gloves.
PBS 10x	Quality Biological	119-069-151	None
PBS	VWR	45000-448	None
Filter Paper	Whatman	8519	N/A
Hand pump	Fisher Scientific	10-239-1	N/A
Graduate Beaker	VitLab	445941	N/A
Cryomill	SPEX	6700	Use cryogloves and eye protection.
Lyophilizer	FTS FlexiDry		Use gloves.
Rheometer	Discovery	HR-2	Use gloves and eye protection.