Это метод для создания 3-мерной клеточной культуры леску от легочной внеклеточного матрикса. Неповрежденными легких перерабатывается в гидрогели, которые могут поддерживать рост клеток в трех измерениях.
Здесь мы представляем метод для создания нескольких компонентов гидрогели для культивирования клеток в пробирке клеток легочной культуры. Начиная с здоровой ткани EN блок легкого из свиных, крысы или мыши, ткань перфузию и погружают в последующих химических моющих средств для удаления остатков клеток. Гистологическое сравнение ткани до и после обработки, подтверждает удаление более 95% двухцепочечной ДНК и альфа-галактозидазы окрашивание предполагает, что большинство клеточных остатков удаляется. После того, как decellularization, ткань подвергают лиофилизации, а затем cryomilled в порошок. Порошок матрицы переваривается в течение 48 ч в кислом растворе пепсином и затем нейтрализуют с образованием раствора Прегелем. Гелеобразования раствора Прегелем может быть индуцирована путем инкубации при 37 ° С и может быть использован сразу же после нейтрализации или хранили при 4 ° С в течение до двух недель. Покрытия могут быть сформированы с использованием раствора Прегелем на необработанной пластины для CELL вложение. Клетки могут быть взвешенными в Прегелем до начала самосборки для достижения 3D культуры, высевали на поверхности формованного геля, из которого клетки могут мигрировать через строительные леса, или плакированной на покрытиях. Изменения в стратегии представлены может повлиять на температуру гелеобразования, прочность, или размеры фрагментов белка. За образованием гидрогеля, жесткость гидрогель может быть увеличена с помощью генипин.
Translating in vitro results to the clinic is one of the most challenging issues facing biomedical researchers. In vitro research on tissue culture plastic is easier, more convenient, and maintains high cell viability.1 This approach is a reasonable starting point, but the results have limited clinical translation. Increasingly, laboratories are incorporating three-dimensional constructs to replace the traditional two-dimensional methods. Reviews are available for many three-dimensional environments, from biological scaffolds to polymeric scaffolds.2,3
Biological frameworks can mimic characteristics of in vivo environments as they contain many of the protein and glycosaminoglycan components of the native matrix and provide familiar binding sites for cells to attach to and recognize. Extracellular matrix (ECM) derived materials have been shown to be capable scaffolds for cell attachment and proliferation.4 One challenge that limits the application of ECM hydrogel platforms stems from their inherently weak mechanical properties following gelation. Native tissue often has mechanical properties that are magnitudes higher than hydrogels. Non-toxic crosslinking agents can increase the mechanical properties of hydrogels to better mimic the native tissue environment. Genipin is a non-toxic, natural crosslinker derived from Gardenia plants with the ability to closely tailor mechanical properties of ECM with changes in genipin concentration5,6.
Nearly all cells in the body exist in, and organize on, ECM that they either produce or maintain. New focus on the universal importance of ECM in the organization, condition, and function in every organ or system has sparked the production of matrix based platforms for in vitro investigation. Porcine small intestine submucosa is the most extensively studied naturally-derived scaffold, and it has been used to regenerate tendons, ligaments, skeletal muscle4, and even bone7. Matrices from other organs and donor species have also demonstrated good tissue regeneration potential. The use of foreign ECM components causes minimal issues with immunomodulation. After elimination of host cellular matter, the remaining ECM will be similar in amino acid content and organization to all other mammalian species8. There is a growing line of thinking that the best way to examine cell-ECM interactions in vitro is to utilize organ-specific ECM scaffolds. Each organ provides a unique composition of proteins and proteoglycans to create cellular niches. Niches provide structural, functional and even the enzymatic breakdown of the extracellular matrix contributing to biophysical signaling. To attain an in vitro microenvironment most similar to the in vivo microenvironment, use of tissue specific ECM would optimize the cellular niches for research.
The goal of this protocol is to provide a method for establishing a hydrogel scaffold unique to the lung ECM. This method provides a platform for in vitro research on lung cell-ECM interactions.
Одним из неотъемлемых аспектов биологии является самоорганизация молекул в иерархических структур, которые выполняют определенную задачу. 13 В лаборатории, самосборка зависит от целого ряда факторов , таких как концентрация соли, рН и продолжительности сбраживания. Как показала…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить Smithfield фермы за пожертвование неповрежденную свиную легочной ткани. Мы также хотели бы поблагодарить д-ра Ху Янг, доктор Кристина Тан и отделение хирургии VCU Plastic за предоставленную нам возможность использовать свое оборудование. Гидрогеля и тканевые образцы были приготовлены для SEM на VCU кафедры анатомии и нейробиологии Микроскопия фонда при поддержке, в частности, путем финансирования из NIH-NINDS Центр Основной Grant 5 P30 NS047463 и, в частности, по форме финансирование NIH-NCI онкологический центр поддержки Грант P30 CA016059. SEM изображения образцов на VCU Nanotechnology Ядро характеризации фонда (НКК). Эта работа финансировалась Национальным научным фондом, CMMI 1351162.
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-100g | Use with eye protection and gloves. |
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500g | None |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016-500g | None |
DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | None |
HCl | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | Use with eye protection and gloves. |
Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887-5G | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | Use with eye protection and gloves. |
Genipin | Wako Chemicals | 078-03021 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
PBS 10x | Quality Biological | 119-069-151 | None |
PBS | VWR | 45000-448 | None |
Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
Hand pump | Fisher Scientific | 10-239-1 | N/A |
Graduate Beaker | VitLab | 445941 | N/A |
Cryomill | SPEX | 6700 | Use cryogloves and eye protection. |
Lyophilizer | FTS FlexiDry | Use gloves. | |
Rheometer | Discovery | HR-2 | Use gloves and eye protection. |