Summary

תאי גזע פלוריפוטנטיים נגזרים תאי לב לתיקון שריר לב

Published: February 03, 2017
doi:

Summary

אנו מציגים שלושה פרוטוקולי רומן ויעילים יותר להבחנה תא גזע מושר אנושי לתוך cardiomyocytes, תאי אנדותל, ותאי שריר חלק ו שיטת הצגה המשפר את engraftment של תאים מושתלים על ידי שילוב הזרקת תא עם משלוח ציטוקינים בתיווך תיקון.

Abstract

תאים אנושיים המושרה גזע פלוריפוטנטיים (hiPSCs) חייב להיות מובחן במלואו לתוך סוגי תאים מסוימים לפני הממשל, אך פרוטוקולים קונבנציונאלי להבחנה hiPSCs לתוך cardiomyocytes (hiPSC-CMS), תאי אנדותל (hiPSC-ECS), ותאי שריר חלק (SMCs) הם בדרך כלל מוגבל על ידי תשואה, טוהר נמוך, ו / או יציבות פנוטיפי עניה. כאן, אנו מציגים פרוטוקולי רומן להפקה hiPSC-CMS, -ECs, ו -SMCs כי הם משמעותיים יותר יעילים מאשר שיטות קונבנציונליות, כמו גם שיטה משלבת הזרקת תא עם טלאי ציטוקינים המכילים נוצרו על האתר של ממשל. המדבקה משפר הן את שימור של התאים מוזרקים, על ידי איטום המסלול מחט כדי למנוע את התאים מפני סחט של שריר הלב, והישרדות התא, על ידי שחרור גורם גדילה דמוי אינסולין (IGF) על פני תקופה ארוכה. במודל החזירים של פגיעה איסכמיה-רה-פרפוזיה בשריר הלב, קצב engraftment היה יותר משני-לקפל יותר כאשרתאים נוהלו עם המדבקה המכיל ציטוקינים בהשוואה לתאים ללא תיקון, וטיפול בשני התאים ואת התיקון, אך לא עם התאים לבד, היה קשור לשיפור בתפקוד לב וגודל אוטם.

Introduction

אדם מושרה בתאי גזע פלוריפוטנטיים (hiPSCs) הם בין סוכני המבטיחים ביותר עבור טיפול בתאי משובים כי הם יכולים להיות מובחנים לתוך מגוון בלתי מוגבל פוטנציאל וכמות התאים שאינם נדחה על ידי המערכת החיסונית של החולה. עם זאת, את יכולת שכפול עצמי והבחנה יכול גם להוביל להיווצרות גידולים, וכתוצאה מכך, hiPSCs צריך להיות מובחן במלואו לתוך סוגי תאים מסוימים, כגון cardiomyocytes (CMS), תאי האנדותל (EC), ותאי שריר חלק (SMCs ), לפני מתן. אחת השיטות הפשוטות והנפוצות ביותר של ממשל תא הוא הזרקת intramyocardial ישירה, אך מספר תאים מושתלים כי הם engrafted ידי רקמת שריר לב הוא היליד נמוך באופן חריג. הרבה התשה זו ניתן לייחס לסביבה ציטוטוקסיות של הרקמה איסכמי; עם זאת, כאשר תאי גזע בעכברים עובריים (ESCs) מוזרקים היו ישירות לתוך שריר הלב של לב וללא כל פגע, only ~ 40% של 5 מיליון התאים נמסרים נשמרו במשך 3-5 שעות 1, אשר טוענת כי חלק ניכר של התאים המנוהלים יצא אתר הממשל, אולי משום שהם היו סחטו דרך מסלול המחט ידי בלחצים הגבוהים הנוצרים במהלך התכווצות שריר הלב.

כאן, אנו מציגים שיטות חדשניות והרבה יותר יעילות להפקה cardiomyocytes hiPSC הנגזרת (hiPSC-CMS) 2, תאי אנדותל (hiPSC-ECS) 3, ותאי שריר חלק (SMCs) 4. יש לציין, פרוטוקול hiPSC-SMC זה הוא ראשון לחקות את המגוון הרחב של מאפיינים מורפולוגיים ופונקציונליים שנצפו סומטיים SMCs 5 על ידי הפניית התאים כלפי פנוטיפ SMC סינטטי או תנועתיים בעיקרה. כמו כן אנו מספקים שיטה של ​​משלוח תא המשפר את קצב engraftment של התאים מוזרקים על ידי יצירת p הפיברין המכילים ציטוקיניםAtch על הזריקה. המדבקה מופיע כדי לשפר הן החזקת התא, על ידי איטום המסלול מחט כדי למנוע את התאים מפני היציאה שריר הלב, והישרדות התא, על ידי שחרור גורם גדילה דמוי אינסולין (IGF) על פני תקופה של שלושה ימים לפחות.

Protocol

כל הפרוצדורות מבוצעות בהתאם להנחיות בעלי חיים מאוניברסיטת אלבמה בבירמינגהם. 1. ההתמיינות hiPSCs לתוך hiPSC-CMS מעיל הבארות של צלחת 6-היטב עם תערובת חלבונים דביקות מראש מקורר צמיחה פקטור-?…

Representative Results

אפיון של הבדיל hiPSC-CMS, -ECs, ו -SMCs קיבולת ההפרש של hiPSCs הוערכה 2, 3, 4. Cytometry זרימה ניתוח לב טרופונין T (cTnT) ביטוי מראים כי טוהר האוכלוסייה hiPSC-CM הסופי יכול…

Discussion

תשואה / טוהר משופר של hiPSC-CMS

פרוטוקולים קונבנציונליים להבחנה תא גזע אנושי לתוך CMS מוגבלים לעתים קרובות על ידי תשואה נמוכה וטוהר; למשל, רק 35-66% של hESC-CMS שהושגו באמצעות הפרדת Percoll היווצרות גוף לב הביעו שרשרת כבדת שרירן איטית או cTnT <sup class="xr…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by US Public Health Service grants NIH RO1s HL67828, HL95077, HL114120, and UO1 HL100407-project 4 (to JZ), an American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG30410018) and a Research Voucher Award from University of Alabama at Birmingham Center for Clinical and Translational Science (to WZ).

Materials

Protocol 1
mTeSR1 medium Stem cell technologies 5850
Growth-factor-reduced matrigel Corning lifescience 356231
Y-27632 Stem cell technologies 72304
B27 supplement, serum free Fisher Scientific 17504044
RPMI1640 Fisher Scientific 11875-119
Activin A R&D 338-AC-010
BMP-4 R&D 314-BP-010
bFGF R&D 232-FA-025
Collagenase IV Fisher Scientific NC0217889
Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous) Fisher Scientific 14175079
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 10438018
6-well plate Corning Lifescience 356721
10cm dish Corning Lifescience 354732
Cell incubator Panasonic MCO-18AC
Materials Company Catalog Number Comments
Protocol 2
Versene Fisher Scientific 15040066
Fibrinogen Sigma-Aldrich F8630-5g
Thrombin Sigma-Aldrich T7009-1KU
EMB2 medium Lonza CC-3156
VEGF ProSpec-Tany CYT-241
EPO Life Technologies PHC9431
TGF-ß Peprotech 100-21C
EGM2-MV medium Lonza CC-4147
SB-431542 Selleckchem S1067
CD31 BD Bioscience BDB555445
CD144 BD Bioscience 560411
15 mL centrifuge tube Fisher Scientific 12565269
Eppendorff Centrifuge Eppendorf 5702R
Materials Company Catalog Number Comments
Protocol 3
CHIR99021 Stem cell technologies 720542
PDGF-ß Prospec CYT-501-10ug
Materials Company Catalog Number Comments
Protocol 4
Olive oil Sigma-Aldrich O1514
Gelatin Sigma-Aldrich G9391
Acetone Sigma-Aldrich 179124
Ethanol Fisher Scientific BP2818100
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882
Glycine Sigma-Aldrich G8898
IGF R&D 291-G1-01M
Bovine serum albumin Fisher Scientific 15561020
Heating plate Fisher Scientific SP88850200
Water bath Fisher Scientific 15-462-10Q
Materials Company Catalog Number Comments
Protocol 5
CaCl2 Sigma-Aldrich 223506
ezh-aminocaproic acid Sigma-Aldrich A0420000
MEM medium Fisher Scientific 12561-056
Syringe Fisher Scientific 1482748
Anesthesia ventilator Datex-Ohmeda 47810
Anesthesia ventilator Ohio Medical V5A
Defibrillator Physiol Control LIFEPAK 15
1.5T MRI General Electric Signa Horizon LX
7T MRI Siemens 10018532
Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) Berlex 50419-188-02
2-0 silk suture Ethilon 685H
3-0 silk suture Ethilon 622H
3-0 monofilament suture Ethilon 627H

Referencias

  1. Qiao, H., et al. Death and proliferation time course of stem cells transplanted in the myocardium. Mol Imaging Biol. 11 (6), 408-414 (2009).
  2. Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
  3. Zhang, S., Dutton, J. R., Su, L., Zhang, J., Ye, L. The influence of a spatiotemporal 3D environment on endothelial cell differentiation of human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (12), 3786-3793 (2014).
  4. Yang, L., et al. Differentiation of Human Induced-Pluripotent Stem Cells into Smooth-Muscle Cells: Two Novel Protocols. PLoS One. 11 (1), e0147155 (2016).
  5. Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Neth Heart J. 15 (3), 100-108 (2007).
  6. Xu, C., Police, S., Hassanipour, M., Gold, J. D. Cardiac bodies: a novel culture method for enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 15 (5), 631-639 (2006).
  7. Anderson, D., et al. Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells. Mol Ther. 15 (11), 2027-2036 (2007).
  8. Huber, I., et al. Identification and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation. FASEB J. 21 (10), 2551-2563 (2007).
  9. Kita-Matsuo, H., et al. Lentiviral vectors and protocols for creation of stable hESC lines for fluorescent tracking and drug resistance selection of cardiomyocytes. PLoS One. 4 (4), e5046 (2009).
  10. Choi, K. D., et al. Hematopoietic and endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (3), 559-567 (2009).
  11. Woll, P. S., et al. Wnt signaling promotes hematoendothelial cell development from human embryonic stem cells. Blood. 111 (1), 122-131 (2008).
  12. Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1701-1710 (2011).
  13. Rufaihah, A. J., et al. Endothelial cells derived from human iPSCS increase capillary density and improve perfusion in a mouse model of peripheral arterial disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (11), e72-e79 (2011).
  14. Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
  15. Qu, Z., et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol. 142 (5), 1257-1267 (1998).
  16. Tang, X. L., et al. Intracoronary administration of cardiac progenitor cells alleviates left ventricular dysfunction in rats with a 30-day-old infarction. Circulation. 121 (2), 293-305 (2010).
  17. Zeng, L., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
  18. Davis, M. E., et al. Local myocardial insulin-like growth factor 1 (IGF-1) delivery with biotinylated peptide nanofibers improves cell therapy for myocardial infarction. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8155-8160 (2006).
  19. Li, Q., et al. Overexpression of insulin-like growth factor-1 in mice protects from myocyte death after infarction, attenuating ventricular dilation, wall stress, and cardiac hypertrophy. J Clin Invest. 100 (8), 1991-1999 (1997).
  20. Wang, L., Ma, W., Markovich, R., Chen, J. W., Wang, P. H. Regulation of cardiomyocyte apoptotic signaling by insulin-like growth factor I. Circ Res. 83 (5), 516-522 (1998).
  21. Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).

Play Video

Citar este artículo
Zhu, W., Gao, L., Zhang, J. Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair. J. Vis. Exp. (120), e55142, doi:10.3791/55142 (2017).

View Video