Pluripotentes células madre derivadas de células cardiacas para la reparación del miocardio
Summary
Presentamos tres protocolos nuevos y más eficientes para la diferenciación de células madre pluripotentes inducidos por el hombre en cardiomiocitos, células endoteliales, y células del músculo liso y un método de entrega que permite mejorar el injerto de las células transplantadas mediante la combinación de la inyección de células con la entrega de citoquinas parche mediada.
Abstract
Las células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs) deben estar completamente diferenciadas en tipos específicos de células antes de la administración, pero los protocolos convencionales para diferenciar hiPSCs en cardiomiocitos (hiPSC-CM), células endoteliales (hiPSC-ECS), y células musculares lisas (CML) son a menudo limitado por bajo rendimiento, la pureza, y / o una pobre estabilidad fenotípica. A continuación, presentamos nuevos protocolos para la generación de hiPSC-CM, -ECs y -SMCs que son sustancialmente más eficiente que los métodos convencionales, así como un método para la combinación de la inyección de células con un parche que contiene citoquinas creado sobre el sitio de administración. El parche mejora tanto la retención de las células inyectadas, sellando el trayecto de la aguja para evitar que las células de ser exprimido hacia fuera del miocardio, y la supervivencia celular, mediante la liberación de factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) durante un período prolongado. En un modelo porcino de la lesión por isquemia-reperfusión del miocardio, la tasa de injerto era más de dos veces mayor cuando lalas células se administraron con el parche que contiene citoquinas en comparación con las células sin parche, y el tratamiento tanto con las células y el parche, pero no con las células solas, se asoció con una mejora significativa en la función cardíaca y el tamaño del infarto.
Introduction
células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs) están entre los agentes más prometedores para la terapia de células regenerativas, ya que pueden ser diferenciadas en una gama potencialmente ilimitado y la cantidad de células que no son rechazadas por el sistema inmune del paciente. Sin embargo, su capacidad de auto-replicación y diferenciación también puede conducir a la formación de tumores y, en consecuencia, hiPSCs necesitar ser totalmente diferenciado en tipos celulares específicos, tales como los cardiomiocitos (CMS), las células endoteliales (EC), y células de músculo liso (SMCs ), antes de la administración. Uno de los métodos más simples y más comunes de administración de las células es la inyección intramiocárdica directa, pero el número de células trasplantadas que se injerta el tejido miocárdico nativa es excepcionalmente bajo. Gran parte de este desgaste se puede atribuir al medio ambiente citotóxica del tejido isquémico; sin embargo, cuando eran células madre embrionarias murinas (CES) inyectados directamente en el miocardio del corazón no lesionados, oólo ~ 40% de los 5 millones de células entregadas fueron retenidas para 3-5 hr 1, lo que sugiere que una proporción sustancial de las células administradas salió del sitio de administración, tal vez porque se exprimen a través del trayecto de la aguja por las altas presiones que se producen durante contracción del miocardio.
A continuación, presentamos los métodos novedosos y sustancialmente más eficientes para la generación de cardiomiocitos derivados de hiPSC (hiPSC-CM) 2, las células endoteliales (hiPSC-ECS) 3, y las células musculares lisas (CML) 4. En particular, este protocolo hiPSC-SMC es la primera para imitar la amplia gama de características morfológicas y funcionales observados en somático SMCs 5 por la dirección de las células hacia un fenotipo predominantemente SMC sintético o contráctil. También proporcionamos un método de suministro de células que mejora la tasa de injerto de las células inyectadas por la creación de una que contiene citoquinas fibrina patch sobre el sitio de inyección. El parche parece mejorar tanto la retención de células, mediante el sellado del trayecto de la aguja para evitar que las células salgan del miocardio, y la supervivencia celular, mediante la liberación de factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) durante un período de al menos tres días.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rendimiento mejorado / pureza de hiPSC-CM
protocolos convencionales para la diferenciación de las células madre humanas en los CM son a menudo limitadas por el bajo rendimiento y la pureza; por ejemplo, solo 35-66% de células madre-CM obtiene a través de la separación de Percoll y la formación de cuerpos cardiaca expresado miosina lenta cadena pesada o cTnT 6. La pureza de las poblaciones hiPSC-CM diferenciadas se puede incrementar sustancialmente mediante la selec…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by US Public Health Service grants NIH RO1s HL67828, HL95077, HL114120, and UO1 HL100407-project 4 (to JZ), an American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG30410018) and a Research Voucher Award from University of Alabama at Birmingham Center for Clinical and Translational Science (to WZ).
Materials
| Protocol 1 | |||
| mTeSR1 medium | Stem cell technologies | 5850 | |
| Growth-factor-reduced matrigel | Corning lifescience | 356231 | |
| Y-27632 | Stem cell technologies | 72304 | |
| B27 supplement, serum free | Fisher Scientific | 17504044 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Activin A | R&D | 338-AC-010 | |
| BMP-4 | R&D | 314-BP-010 | |
| bFGF | R&D | 232-FA-025 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | NC0217889 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous) | Fisher Scientific | 14175079 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10438018 | |
| 6-well plate | Corning Lifescience | 356721 | |
| 10cm dish | Corning Lifescience | 354732 | |
| Cell incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 2 | |||
| Versene | Fisher Scientific | 15040066 | |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F8630-5g | |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T7009-1KU | |
| EMB2 medium | Lonza | CC-3156 | |
| VEGF | ProSpec-Tany | CYT-241 | |
| EPO | Life Technologies | PHC9431 | |
| TGF-ß | Peprotech | 100-21C | |
| EGM2-MV medium | Lonza | CC-4147 | |
| SB-431542 | Selleckchem | S1067 | |
| CD31 | BD Bioscience | BDB555445 | |
| CD144 | BD Bioscience | 560411 | |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 12565269 | |
| Eppendorff Centrifuge | Eppendorf | 5702R | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 3 | |||
| CHIR99021 | Stem cell technologies | 720542 | |
| PDGF-ß | Prospec | CYT-501-10ug | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 4 | |||
| Olive oil | Sigma-Aldrich | O1514 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| IGF | R&D | 291-G1-01M | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | 15561020 | |
| Heating plate | Fisher Scientific | SP88850200 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10Q | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 5 | |||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 223506 | |
 -aminocaproic acid |
Sigma-Aldrich | A0420000 | |
| MEM medium | Fisher Scientific | 12561-056 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 1482748 | |
| Anesthesia ventilator | Datex-Ohmeda | 47810 | |
| Anesthesia ventilator | Ohio Medical | V5A | |
| Defibrillator | Physiol Control | LIFEPAK 15 | |
| 1.5T MRI | General Electric | Signa Horizon LX | |
| 7T MRI | Siemens | 10018532 | |
| Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) | Berlex | 50419-188-02 | |
| 2-0 silk suture | Ethilon | 685H | |
| 3-0 silk suture | Ethilon | 622H | |
| 3-0 monofilament suture | Ethilon | 627H |
Referencias
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