Summary

Pluripotentes Stem Cell Derivado células cardíacas para reparo do miocárdio

Published: February 03, 2017
doi:

Summary

Apresentamos três protocolos de novos e mais eficientes para a diferenciação de células estaminais pluripotentes humanas induzida em cardiomiócitos, células endoteliais, e células do músculo liso e um método de entrega que melhora o enxerto de células transplantadas através da combinação de injecção das células com citocinas entrega mediada por remendo.

Abstract

Humanos induzida células-tronco pluripotentes (hiPSCs) deve ser totalmente diferenciado em tipos específicos de células antes da administração, mas protocolos convencionais para diferenciar hiPSCs em cardiomiócitos (hiPSC-CMS), células endoteliais (hiPSC-ECs), e células musculares lisas (SMCs) são muitas vezes limitada pelo baixo rendimento, pureza e / ou pobre estabilidade fenotípica. Aqui, nós apresentamos novos protocolos para gerar hiPSC-CMs, -ECs, e -SMCs que são substancialmente mais eficiente do que os métodos convencionais, bem como um método para a combinação de injecção de células com um penso contendo citocina criado ao longo do local de administração. O remendo melhora tanto a retenção das células injectadas, por meio de selagem da faixa de agulha para impedir que as células de ser espremido para fora do miocárdio, e a sobrevivência de células, através da libertação do factor de crescimento semelhante a insulina (IGF), durante um período prolongado. Num modelo suíno de lesão de isquemia-reperfusão do miocárdio, a taxa de enxerto era mais do que duas vezes maior quando oAs células foram administrados com o remendo contendo citoquinas em comparação com as células, sem mancha, e o tratamento com ambos as células e o remendo, mas não apenas com as células, foi associada com melhorias significativas na função cardíaca e o tamanho do enfarte.

Introduction

As células estaminais pluripotentes humanas induzida (hiPSCs) estão entre os agentes mais promissores para a terapia celular regenerativo porque eles podem ser diferenciadas em uma gama potencialmente ilimitada e a quantidade de células que não são rejeitadas pelo sistema imunitário do paciente. No entanto, a sua capacidade de auto-replicação e diferenciação podem também levar à formação de tumor e, consequentemente, hiPSCs precisa ser totalmente diferenciadas em tipos de células específicos, tais como cardiomiócitos (CMS), células endoteliais (ECs), e células do músculo liso (SMCs ), antes da administração. Um dos métodos mais simples e mais comum de administração da célula é a injecção directa intramiocardial, mas o número de células transplantadas que são enxertados pelo tecido do miocárdio nativa é excepcionalmente baixa. Muito deste atrito pode ser atribuído ao ambiente citotóxica do tecido isquémico; No entanto, quando as células estaminais embrionárias de murídeo (CES) foram injectados directamente no miocárdio de corações não lesionados, óomente ~ 40% dos 5 milhões de células foram entregues retida durante 3-5 h 1, o que sugere que uma proporção substancial das células administradas saiu do local de administração, talvez por terem sido espremidos para fora através do percurso da agulha pelas altas pressões produzidas durante contração do miocárdio.

Aqui, apresentamos métodos novos e substancialmente mais eficientes para a geração de cardiomiócitos hiPSC derivados (hiPSC-CMS) 2, células endoteliais (hiPSC-ECs) 3, e células musculares lisas (SMCs) 4. Notavelmente, este protocolo hiPSC-SMC é o primeiro a imitar a vasta gama de características morfológicas e funcionais observadas em somática SMCs 5 direccionando as células para um fenótipo de SMC contráctil ou predominantemente sintética. Também fornecemos um método de entrega de células que melhora a taxa de enxerto de células injectadas através da criação de uma citocina de fibrina contendo Patch sobre o local da injecção. O remendo parece melhorar a retenção de células, por meio de selagem da faixa da agulha para evitar que as células se sair do miocárdio, e a sobrevivência de células, através da libertação do factor de crescimento semelhante a insulina (IGF) ao longo de um período de pelo menos três dias.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais são realizados de acordo com as Diretrizes Animal da Universidade de Alabama em Birmingham. 1. Diferenciando hiPSCs em hiPSC-CMs Revestir os poços de uma placa de 6 poços com mistura de proteína gelatinoso pré-arrefecido a-factor de crescimento reduzida, a 4 ° C durante a noite. Aspirar a mistura gelatinosa proteína antes da utilização. Semear o hiPSCs nas placas pré-revestidas, e as células de cultura (1 x 10 5 células p…

Representative Results

Caracterização de Diferenciada hiPSC-CMs, -ECs e -SMCs A capacidade diferencial de hiPSCs foram avaliados 2, 3, 4. Análises de citometria de fluxo de expressão de troponina T (TnT) sugerem que a pureza da população final hiPSC-CM pode exceder 90% (Figura 1A, 1B, painel B1). Quase todas as células …

Discussion

Melhorou Rendimento / Pureza de hiPSC-CMs

protocolos convencionais para diferenciação de células-tronco humanas no CMS são muitas vezes limitadas pela baixa produtividade e pureza; por exemplo, apenas 35-66% das hESC-CMs obtido via separação Percoll e formação do corpo cardíaca expressa lento miosina de cadeia pesada ou cTnT 6. A pureza das populações hiPSC-CM diferenciadas pode ser substancialmente aumentada, seleccionando para a expressão de um gene repórt…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by US Public Health Service grants NIH RO1s HL67828, HL95077, HL114120, and UO1 HL100407-project 4 (to JZ), an American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG30410018) and a Research Voucher Award from University of Alabama at Birmingham Center for Clinical and Translational Science (to WZ).

Materials

Protocol 1
mTeSR1 medium Stem cell technologies 5850
Growth-factor-reduced matrigel Corning lifescience 356231
Y-27632 Stem cell technologies 72304
B27 supplement, serum free Fisher Scientific 17504044
RPMI1640 Fisher Scientific 11875-119
Activin A R&D 338-AC-010
BMP-4 R&D 314-BP-010
bFGF R&D 232-FA-025
Collagenase IV Fisher Scientific NC0217889
Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous) Fisher Scientific 14175079
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 10438018
6-well plate Corning Lifescience 356721
10cm dish Corning Lifescience 354732
Cell incubator Panasonic MCO-18AC
Materials Company Catalog Number Comments
Protocol 2
Versene Fisher Scientific 15040066
Fibrinogen Sigma-Aldrich F8630-5g
Thrombin Sigma-Aldrich T7009-1KU
EMB2 medium Lonza CC-3156
VEGF ProSpec-Tany CYT-241
EPO Life Technologies PHC9431
TGF-ß Peprotech 100-21C
EGM2-MV medium Lonza CC-4147
SB-431542 Selleckchem S1067
CD31 BD Bioscience BDB555445
CD144 BD Bioscience 560411
15 mL centrifuge tube Fisher Scientific 12565269
Eppendorff Centrifuge Eppendorf 5702R
Materials Company Catalog Number Comments
Protocol 3
CHIR99021 Stem cell technologies 720542
PDGF-ß Prospec CYT-501-10ug
Materials Company Catalog Number Comments
Protocol 4
Olive oil Sigma-Aldrich O1514
Gelatin Sigma-Aldrich G9391
Acetone Sigma-Aldrich 179124
Ethanol Fisher Scientific BP2818100
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882
Glycine Sigma-Aldrich G8898
IGF R&D 291-G1-01M
Bovine serum albumin Fisher Scientific 15561020
Heating plate Fisher Scientific SP88850200
Water bath Fisher Scientific 15-462-10Q
Materials Company Catalog Number Comments
Protocol 5
CaCl2 Sigma-Aldrich 223506
ezh-aminocaproic acid Sigma-Aldrich A0420000
MEM medium Fisher Scientific 12561-056
Syringe Fisher Scientific 1482748
Anesthesia ventilator Datex-Ohmeda 47810
Anesthesia ventilator Ohio Medical V5A
Defibrillator Physiol Control LIFEPAK 15
1.5T MRI General Electric Signa Horizon LX
7T MRI Siemens 10018532
Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) Berlex 50419-188-02
2-0 silk suture Ethilon 685H
3-0 silk suture Ethilon 622H
3-0 monofilament suture Ethilon 627H

Referencias

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Citar este artículo
Zhu, W., Gao, L., Zhang, J. Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair. J. Vis. Exp. (120), e55142, doi:10.3791/55142 (2017).

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