Verdunstungsmindernde Kultur Zustand Erhöht die Reproduzierbarkeit von mehrzelligen Sphäroidformation in Mikrotiterplatten
Summary
Die ungleichmäßige Verlust von Medium aus Mikrotiterplatten wirkt sich auf die Reproduzierbarkeit einheitlicher vielzelligen Tumor Sphäroidformation. Kulturbedingungen zu verbessern signifikant Medium Verlust zu reduzieren wird die Reproduzierbarkeit der Sphäroidbildung und die Ergebnisse der Sphäroid basierenden Assays unter Verwendung der flüssig overlay-Technik verbessern.
Abstract
Tumormodellen , die eng de – vivo – Bedingungen nachahmen werden immer beliebter in der Wirkstoffforschung und Entwicklung für das Screening von potenziellen Anti-Krebs – Medikamente. Vielzellige Tumorsphäroide (MCTSes) effektiv die physiologischen Bedingungen von soliden Tumoren zu imitieren, so dass sie eine ausgezeichnete In – vitro – Modelle für die Lead – Optimierung und Target – Validierung zu machen. Von den verschiedenen Techniken zur Verfügung, für MCTS Kultur, die Flüssig-Overlay-Verfahren auf Agarose ist eine der preiswertesten Methoden zur MCTS-Generation. Jedoch ist die zuverlässige Übertragung von MCTS-Kulturen unter Verwendung von Flüssig-Overlay für Hochdurchsatz-Screening durch eine Reihe von Einschränkungen beeinträchtigt werden, einschließlich der Beschichtung von Mikrotiterplatten (MPs) mit Agarose und die Nichtreproduzierbarkeit einheitlicher MCTS Bildung über Vertiefungen können. Abgeordnete sind deutlich anfälliger Auswirkungen auf Kante, die durch übermäßige Verdunstung des Mediums von der Außenseite der Platte führen, für Arzneimittel, die Verwendung der gesamten Platte zu verhindernTests. Dieses Manuskript enthält detaillierte technische Verbesserungen an der Flüssig-Overlay-Technik, um die Skalierbarkeit und Reproduzierbarkeit einheitlicher MCTS Bildung zu erhöhen. Zusätzlich Details zu einem einfachen, halbautomatische und universell einsetzbare Software-Tool zur Auswertung von MCTS verfügt nach der Arzneimittelbehandlung präsentiert wird.
Introduction
Krebszellen in Tumoren sind physiologisch in einem Komplex, 3-dimensionale (3D) Struktur, die durch extrazelluläre Matrix und die Interaktion Zellen umgeben angeordnet ist. Da fast alle Zellen in Geweben in einer 3D – Umgebung befinden, hat sich die Notwendigkeit für mehr physiologisch relevanten in vitro – Tumormodellen , die Tumormerkmale nachahmen 3 in der Entwicklung mehrerer 3D – Kulturtechniken 1, 2 geführt. Diese Modelle werden nun die Grundlagenforschung Werkzeuge für die Untersuchung der Rolle des Tumor – Mikroumgebung auf die Metastasierung und Zellantwort auf Therapeutika in 3D 2. Darüber hinaus, im Vergleich zu 2-dimensionale (2D) 4 – Zellkulturen erlauben 3D – Modelle für ein besseres Verständnis der Tumor-Stroma – Wechselwirkungen, die Zellsignalwege beeinflussen.
Vielzellige Tumorsphäroide (MCTSes) von Krebszelllinien werden häufig in 3D-Zelle c verwendetulture Modelle aufgrund ihrer relativen Nähe zu in vivo Tumoren. Von den verschiedenen Techniken in Gebrauch, die Flüssigkeit-overlay – Technik (LOT) des MCTS Generation auf Agarose-beschichteten Platten hat erhebliches Interesse für Lead – Optimierung und Target – Validierung 5 gewonnen, 6, 7, 8, 9, 10, 11. Dies ergibt sich aus den jüngsten Studien , die erfolgreich in der Lage waren Pilot Bildschirme von Substanzbibliotheken in MCTS Kulturen 7 mit LOT 6, zu laufen. Doch auch zu gut Variabilität in MCTS Morphologie und das Wachstum durch die Verdunstung induzierte uneben Medienverlust sind häufig Hürden, die die LOT mit Mikrotiterplatten (MPs) begleiten. Folglich beeinträchtigt die Bildung von ungleichmäßigen MCTSes die Bedeutung und Relevanzvon Daten aus pharmakologischen Assays 8, 12, 13. Zusätzlich zu den Reproduzierbarkeit Fragen, ein weiteres praktisches Problem, das LOT-basierte Assays mit hohem Durchsatz beeinflusst, ist die Beschichtung der MPs mit Agarose, wenn die automatische Flüssigkeitsabgabeeinheiten verwendet wird. Obwohl die Abgabeeinheit erhitzt gehalten werden kann , das Gelieren von Agarose zu verhindern, ist das Verstopfen der Ausgabekassette und Schläuche ein potenzielles Problem für Robotersysteme 6.
Um einige dieser Herausforderungen zu bewältigen, haben wir vor kurzem ein paar Änderungen in der LOT für MCTS Kultur 8 entwickelt. Diese Modifikationen werden hauptsächlich auf mögliche Wege zu einer ungleichmäßigen Medium Verlust zu verhindern von den Abgeordneten mit Hilfe von Instrumenten, die zu finden sind, in Hochdurchsatz-Screening-Labors. Eine detaillierte Prozedur des modifizierten LOT für die Erzeugung von gleichmäßiger Größe und reproduzierbaren MCTSes über 384-Well-Platten (WPs) wird hier vorgestellt. Das Manuskript stellt auch eine halbautomatische Routine zur Auswertung von MCTS Größe, insbesondere in teilweise zersetzten, arzneimittelbehandelten MCTSes, die für die Messung der Querschnittsfläche keine klar definierte Grenze aufweisen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Beschichtung 384-Well TC Platten mit Filtered Agarose
Die gängige Praxis in LOT ist ein 1-1,5% niedrig schmelzender Agarose zu beschichten , um die Platten zu verwenden, die die Agarose und / oder Abgabeeinheit erfordert gehalten werden erhitzt , um die Gelierung der Agarose 6 zu verhindern. Das Gelieren der Agarose ist potenziell besorgniserregende, während mehrere Platten unter Verwendung von flüssigem Dispensierkassetten kleinen Schlauchöffnungen im Bereich zw…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem tschechischen Ministerium für Bildung, Jugend und Sport (LO1304) und der Technischen Agentur der Tschechischen Republik (TE01020028) unterstützt. Die Autoren möchten sich für die Aufnahme von Standbildern von Umwelt Deckel Dr. Lakshman Varanasi zu danken.
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Low-melting |
| McCOY's 5A Medium | Sigma-Aldrich | M8403 | |
| “rapid” Filtermax filter | TPP | 99505 | 0.22 μm, 500 mL |
| Multidrop™ Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | 5840300 | |
| Small Tube Dispensing cassette | Thermo Fisher Scientific | 24073295 | Metal tip |
| 384-well TC plate | PerkinElmer | 6057308 | Plate type- CellCarrier |
| Standard Tube Dispensing Cassette | Thermo Fisher Scientific | 24072670 | |
| MicroClime Environmental Lid | Labcyte | LLS-0310 | |
| DMSO | Sigma | D4540 | |
| Rotary Incubator (SteriStore ) | HighRes Biosolutions | 23641 | Serial No.: D00384 |
| Microplate Washer Dispenser | BioTek | Unspecified | Model: EL406 |
| High-Content Imaging System (CellVoyager ) | Yokogawa Electric Corporation | Unspecified | Model: CV7000 |
| Orange G | New England Biolabs | B7022S | |
| TrypLE™ Express recombinant cell dissociation reagent | Thermo Fisher Scientific | 12604021 | Phenol red free |
Referencias
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