Evaporazione di riduzione Cultura Condizione Aumenta la riproducibilità dei multicellulare Spheroid Formazione in micropiastre
Summary
La perdita irregolare del mezzo da micropiastre influisce sulla riproducibilità del multicellulare formazione del tumore sferoide uniforme. Il miglioramento delle condizioni di coltura per ridurre la perdita significativa medio migliorare la riproducibilità della formazione sferoide ei risultati dei dosaggi sferoidali a base usando la tecnica liquido-overlay.
Abstract
Modelli tumorali che strettamente imitano le condizioni in vivo stanno diventando sempre più popolare in scoperta di nuovi farmaci e lo sviluppo per lo screening di potenziali farmaci anti-cancro. Sferoidi tumorali multicellulari (MCTSes) imitano in modo efficace le condizioni fisiologiche di tumori solidi, che li rende eccellente de modelli in vitro per l'ottimizzazione di piombo e validazione del target. Tra le varie tecniche disponibili per la cultura MCTS, il metodo liquido-overlay su agarosio è uno dei metodi più economiche per la generazione MCTS. Tuttavia, il trasferimento affidabile di culture MCTS utilizzando liquido-overlay per high-throughput screening può essere compromessa da una serie di limitazioni, tra cui il rivestimento di piastre microtiter (MP) con agarosio e l'irriproducibilità di formazione MCTS uniforme attraverso pozzi. Mp sono significativamente inclini a effetti di bordo che derivano da eccessiva evaporazione del mezzo dall'esterno della piastra, impedendo l'uso della intera piastra per drogatest. Questo manoscritto fornisce miglioramenti tecnici dettagliati alla tecnica liquido-overlay per aumentare la scalabilità e la riproducibilità di formazione uniforme MCTS. Inoltre, dettagli su un semplice, strumento software semi-automatico, e universalmente applicabile per la valutazione delle caratteristiche MCTS dopo trattamento farmacologico è presentato.
Introduction
Le cellule tumorali nei tumori sono fisiologicamente disposti in un complesso di 3-dimensionale struttura, (3D), circondato da matrice extracellulare e le cellule interagiscono. Come quasi tutte le cellule nei tessuti risiedono in un ambiente 3D, la necessità di più fisiologicamente rilevanti de modelli tumorali in vitro che imitano tratti tumorali ha portato allo sviluppo di varie tecniche di coltura 3D 1, 2, 3. Questi modelli stanno diventando strumenti di ricerca fondamentali per studiare il ruolo del microambiente tumorale sulla metastasi e delle cellule risposta alle terapie in 3D 2. Inoltre, rispetto al 2-dimensionali culture (2D) di cella 4, modelli 3D consentono una migliore comprensione delle interazioni tumore-stroma, che interessano vie di segnalazione cellulare.
sferoidi tumorali multicellulari (MCTSes) su linee cellulari tumorali sono spesso utilizzati nella cella 3D cmodelli ULTURA a causa della loro relativa vicinanza ai tumori in vivo. Delle diverse tecniche in uso, la tecnica liquido overlay (LOT) di generazione MCTS su piastre di agarosio rivestite ha raggiunto livelli significativi per l'ottimizzazione di piombo e di destinazione convalida 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11. Questo è evidente dai recenti studi che sono stati con successo in grado di eseguire schermi pilota di librerie di composti nelle culture MCTS utilizzando Lotto 6, 7. Tuttavia, well-to-bene variabilità MCTS morfologia e la crescita a causa della perdita irregolare di evaporazione indotta di media sono ostacoli comuni che accompagnano la LOT utilizzando micropiastre (MPS). Di conseguenza, la formazione di non uniforme MCTSes compromette la significatività e rilevanzaI dati ottenuti in saggi farmacologici 8, 12, 13. Oltre ai problemi di riproducibilità, un altro problema pratico che colpisce saggi high throughput LOT-base è il rivestimento dei mp con agarosio utilizzando liquido automatica unità di erogazione. Sebbene l'unità di dosaggio può essere mantenuto riscaldato per evitare la gelificazione agarosio, l'intasamento della cassetta erogazione e il tubo è un potenziale preoccupazione per sistemi robotici 6.
Per superare alcune di queste sfide, abbiamo recentemente messo a punto alcune modifiche nella LOT per MCTS cultura 8. Queste modifiche si basano principalmente sui possibili modi per prevenire la perdita media irregolare dai deputati con strumenti che si trovano comunemente nei laboratori high-throughput screening. Una procedura dettagliata della LOT modificato per la generazione di MCTSes uniformemente dimensioni e riproducibili attraverso 3Piastre 84 pozzetti (WP) è presentato qui. Il manoscritto presenta anche una routine semi-automatizzato per la valutazione delle dimensioni MCTS, particolarmente in parzialmente disintegrate, MCTSes trattati con farmaci che non hanno un confine ben definito per la misura della sezione trasversale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rivestimento 384 pozzetti TC con filtrata Agarosio
La pratica standard in LOT è utilizzare un punto agarosio bassofondente 1-1,5% per rivestire le piastre, che richiede l'agarosio e / o unità di dosaggio da tenere riscaldata per impedire la gelificazione del agarosio 6. La gelificazione agarosio è potenzialmente preoccupanti durante la preparazione di piastre multiple utilizzando cassette dosaggio liquidi con piccole aperture tubi compresi tra 0,2 e 0,4 mm di diam…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal ministero ceco dell'Istruzione, della gioventù e dello sport (LO1304) e l'Agenzia Tecnologica della Repubblica Ceca (TE01020028). Gli autori desiderano ringraziare il Dott Lakshman Varanasi per scattare le immagini fisse di coperchi ambientali.
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Low-melting |
| McCOY's 5A Medium | Sigma-Aldrich | M8403 | |
| “rapid” Filtermax filter | TPP | 99505 | 0.22 μm, 500 mL |
| Multidrop™ Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | 5840300 | |
| Small Tube Dispensing cassette | Thermo Fisher Scientific | 24073295 | Metal tip |
| 384-well TC plate | PerkinElmer | 6057308 | Plate type- CellCarrier |
| Standard Tube Dispensing Cassette | Thermo Fisher Scientific | 24072670 | |
| MicroClime Environmental Lid | Labcyte | LLS-0310 | |
| DMSO | Sigma | D4540 | |
| Rotary Incubator (SteriStore ) | HighRes Biosolutions | 23641 | Serial No.: D00384 |
| Microplate Washer Dispenser | BioTek | Unspecified | Model: EL406 |
| High-Content Imaging System (CellVoyager ) | Yokogawa Electric Corporation | Unspecified | Model: CV7000 |
| Orange G | New England Biolabs | B7022S | |
| TrypLE™ Express recombinant cell dissociation reagent | Thermo Fisher Scientific | 12604021 | Phenol red free |
Referencias
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