C. 线虫排泄管作为细胞内腔形态发生和体内极化膜生物在单个细胞中的模型: GFP-融合、rna 干扰界面和成像的标记
Summary
C. 线虫排泄管是一种独特的单细胞模型, 用于可视化的体内分析从头生物极化膜。该协议描述了标准的遗传/rna 干扰和成像方法相结合, 适用于定向单细胞 tubulogenesis、顶端膜和腔生物的分子的鉴定和表征。
Abstract
四C. 线虫排泄运河是狭窄的管子延伸通过动物的长度从一个单细胞, 与几乎相等地延长的细胞内 endotubes 修造和稳定流明用膜和 submembraneous顶端字符的骨架。排泄细胞扩大其长度约2000倍, 以产生这些运河, 使该模型独特的在体内评估的de 从头极化膜生物, 胞内管腔内形态发生和单细胞tubulogenesis这里介绍的协议显示了如何结合标准标记, 增益和功能的遗传或 rna 干扰, 和微观的方法, 使用这个模型, 视觉解剖和功能分析这些过程的分子水平。作为标记方法的一个示例, 该协议概述了用荧光融合蛋白生成转基因动物, 用于 tubulogenesis 的实时分析。作为一种遗传方法的例子, 它突出了视觉 RNAi-based 交互界面的关键点, 旨在改变功能囊状管的表型。所描述的具体方法是如何: 通过表达荧光蛋白来标记和可视化运河;构建有针对性的 rna 干扰文库, 并制定策略性 rna 筛选方法, 对运河形态发生的分子分析;视觉评估运河表型的改变;通过解剖荧光显微镜对其进行评分;用共焦显微镜对高分辨率亚细胞导管成分进行表征;并量化可视化参数。该方法对于有兴趣利用C. 线虫排泄管的研究人员是有用的, 用于识别和表征细胞内腔和单细胞 phylogenetically 保守过程中涉及的基因。管状形态。
Introduction
所有的内脏器官都是由管子组成的, 它们的各种功能非常关键, 如气体、液体和养分的运输和交换, 以及代谢废物的排泄。他们的极化特性, 具有独特的顶端和腔膜, 是适应这些特定功能, 和缺陷的生物其内膜和细胞膜系统是一个常见的原因, 人类疾病1,2。血管和内脏的大多数管是多细胞的, 形成流明 intercellularly;然而, 单细胞管, 形成流明细胞, 可以, 例如, 代表多达30-50% 人毛细血管床2。和单细胞管的极化膜在成分上是相似的, 虽然它们的微可能根据管的特定功能而有所不同 (例如, 在线虫中, 排泄管小与小肠微绒毛) 线虫;有关C. 线虫肠道 tubulogenesis)3的附随纸张。极化膜生物和 tubulogenesis 的原理在后生中保存, 而类似的分子机械则指示它们1,2,4。
线虫排泄系统由五细胞组成: 排泄细胞 (EC)、导管细胞 (DC)、孔隙细胞 (PC) 和两个腺体细胞。消融的 EC, DC 或 PC 导致体液积聚在体腔和动物死亡早期幼虫阶段5。有趣的是, 这三单细胞生物用三种不同的方式创造了它们的流明: 细胞空洞化 (EC);细胞包裹结合 autocellular 结形成 (个人计算机);与 autofusion (DC) 相结合的细胞包裹;腔内形态发生的不同机制都是 phylogenetically 保守的6,7。该 EC 位于咽后部的左外侧, 发出两个侧向延伸, 四根运河伸出来将前和向后 (在左右两侧) 延伸到蠕虫的鼻尖和尾部。分别 (图 1)5、6、8。EC 从大约1µm 延伸到 2 x 1000 µm, 使它成为动物中最大的细胞。在亚细胞水平上, 排泄管是一个简单的管, 产生从一个基膜的方向 pseudocoelom, 并通过隧道腔膜 (endotube)。运河腔膜连接到导管腔膜在其唯一的细胞间结;运河是否则 junctionless 沿他们的长度 (图 1)。排泄管腔膜及其 submembraneous 细胞骨架顶端, 其分子组成的定义, 类似的顶端膜的组成和 submembraneous 细胞骨架的多细胞管, 如肠道,和其他 (如, 扁平) 上皮细胞。细胞质细胞器, 包括内涵水泡和其他 (如, 高尔基体) endomembranes 沿运河的长度分布。此外, 多个小囊泡–或者连接到腔膜, 和/或互联, 或隔离–通过运河细胞质7,8,9,10.这种动态的等离子膜/小连接进一步扩大了运河的膜系统, 并有助于流明形态发生和渗透10。因此, 排泄管几乎完全由内膜和细胞膜组成, 为极化膜生物的分析和细胞膜界面的调节提供了良好的模型。在运河 morphogenesis-in 的顶端膜的戏剧性扩展这个单细胞系统与流明扩展一致-也允许分析因需要稳定和中心的细胞内腔膜所引起的建筑问题.本议定书的重点是分析运河管和流明的结构形态发生和细胞内膜动力学所需的这个过程, 而不是信号的细胞运动, 产生 EC 的位置在排泄系统和构造它与其他细胞元素的错综复杂的连接 (在6中进行了回顾)。
C. 线虫单细胞管系统的进一步优势对极化膜和胞内腔的分析生物是它的能力分离, 通过发展时间, 它的细胞膜的不同的组分的世代和路口。EC 出生于腹侧闭合时, 在中期胚胎发育期间腹侧咽,5,6,8, 其间出现侧向管延伸和分支。随后是晚期胚胎发生后的前段后道延长, 这一过程将持续到 L1-larval 阶段 (图 1)。在一个新孵出的幼虫中, 后管尖端达到近似的蠕虫中间, 完全延伸到尾部的 L1 阶段结束, 之后的时间运河拉长与蠕虫8。在第一个幼体阶段, 以高于动物生长速度的活性运河生长结束, 然而, 在其他幼体期 (L2–4) 中, 进一步的生长与整个动物的生长同时发生。此设置提供了一个机会来分析不同的步骤, de 从头极化膜生物独立于极化细胞分裂或迁移。此外, 它允许分离这个过程从接合 (在胚胎发生在流明开始之前);它们在膜极化中的确切要求在极性领域仍然是一个开放的问题。最后, 它唯一的分离顶端从基底膜扩张, 后者的过程前在排泄运河10。因此, C. 线虫排泄管模型是一种特别翔实的肠道模型的补充, 它在极化膜生物的分析中具有许多优点, 但在多细胞环境中执行它 (见肠道 tubulogenesis 的附文3)。
虽然野生型运河是超薄小管在这个微小的蠕虫, 他们的流明可以是 visualized 直接由 Nomarski 光学在这透明动物。实际上, 突变型的胆囊管形态可以用低放大解剖显微镜来描述, 它在前向遗传筛检中的应用对 tubulogenesis11中所涉及的基因有很大的影响。改进的可视化的运河形态学和他们的极化膜, 骨架成分, 不同的细胞器和其他亚结构的区别, 但是, 需要标记和更高的功率荧光解剖和共聚焦显微镜。虽然运河的精细结构带来了许多困难的标签和显微镜, 膜和亚细胞成分可以区分通过特定的分子每个舱室, 和动物可以安全地安装显微镜, 如果采取了某些预防措施以避免引入工件 (请参见协议和讨论)。标记可以通过免疫组织化学在固定标本, 或通过生成转基因蠕虫表达荧光融合蛋白在自己的控制下或排泄管特定促进剂为在体内成像。本协议描述后一种标记技术 (参见有关肠道 tubulogenesis 抗体染色的附文3)。
在整个开发过程中, 将在体内丢失-或功能研究与活体成像分析结合在一起的能力使线虫排泄管成为一个特别强的分子模型和单细胞 tubulogenesis 的细胞分析。向前或反向的遗传屏幕可以执行从野生类型或标记的转基因动物, 以确定运河的形态发生表型 (例如, 囊肿) 及其潜在的基因缺陷。或者, 这样的屏幕可以从突变型 (例如, 囊性管) 开始, 并识别此表型的抑制因子或增强剂, 以确定与导致突变型的基因功能交互的基因。导致突变表型的遗传缺陷可能导致损失 (例如、 via基因缺失) 或增益 (如、通过激活突变或通过引入过量的基因拷贝) 的研究功能。前瞻性突变或系统的 rna 干扰屏幕是没有先入为主的基因功能, 并允许无偏见的基因识别涉及的功能的兴趣。考虑到基因组范围内的 rna 干扰喂养库的可用性, 几乎所有的基因都可以通过在线虫中的 rna 干扰而被轻易地击倒, 这样, 任何一个感兴趣的基因或任何一组基因 (如如, 在目标屏幕中) 也可以快速探测为他们的效果在反向遗传学方法。为了演示一种可能的方法组合, 我们在这里描述一个有针对性的 rna 干扰互动屏幕, 从一个功能囊性排泄管突变体, 标记为细胞质管绿色荧光蛋白 (GFP)。突变型的表现是由过度表达的erm-1, 高度保守的C. 线虫同源的膜-肌动蛋白连接器家族 Ezrin-Radixin-Moesin (erm), 这已牵连到流明形态发生和膜组织在许多种类12。C. 线虫ERM-1 本地化到内脏器官的腔膜, 如排泄管和肠道, 并且在两个13中都需要流明形成。ERM-1 过度肌动蛋白和小泡到运河腔膜, 增加通量到流明和产生短囊管和卷曲腔膜与加厚肌动蛋白底漆9。该协议描述了如何产生具有排泄管表达的融合蛋白 (或其他蛋白质) 的转基因菌株;如何执行有针对性的 rna 干扰屏幕, 从这样的菌株开始, 以确定一个运河表型的修饰剂;以及如何通过荧光解剖和共聚焦显微镜对这些屏幕的结果进行直观的分析, 包括简单的方法来量化信息 tubulogenesis 表型。替代标记技术和 rna 干扰的细节, 调整到经常致命的 tubulogenesis 基因, 可以发现在肠道 tubulogenesis3的陪同文件。所有的方法都可以用于各种组合, 用于调查运河 tubulogenesis 的其他问题。
Protocol
Representative Results
Discussion
线虫 “遗传多样性、透明性、简单的体计划和不变的细胞谱系都使其成为分析形态发生的良好模型。该协议描述了如何结合标准的遗传操作和成像研究, 以利用2微米薄的线虫排泄运河研究极化膜和细胞内腔生物在一个单一的细胞管。
标签
C. 线虫排泄管可以用荧光融合蛋白的表达进行标记, 允许活体分析 (此处描述), 或通过抗体或化学染色 (见…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢 m. Buechner (堪萨斯大学, 堪萨斯州, 美国), k Nehrke (罗切斯特大学医学中心, 罗切斯特, 纽约, 美国), 和线虫遗传学中心, 由国家卫生研究院资助, 研究基础设施办公室程序 (P40 OD010440)。这项工作得到了资助, NIH GM078653, MGH 是224570和223809至 iii
Materials
| Cloning | |||||
| Plasmid pPD95.75 | Addgene | Cat. No. 37464 | |||
| PCR Kit | Qiagen | Cat. No. 27106 | |||
| Ligation kit | New England Biolabs | Cat. No. E2611L | |||
| DNA marker | Thermo Scientific | Cat. No. SM1331 | |||
| Agarose DNA grade | Fisher Scientific | Cat. No. BP164-100 | |||
| Competent cells | New England Biolabs | Cat. No. C2987H | |||
| Tris | Fisher Scientific | Cat. No. BP154-1 | |||
| EDTA | Sigma | Cat. No. ED-1KG | |||
| Acetic acid | Fisher Scientific | Cat. No. A38S-500 | |||
| Ethidium bromide | Fisher Scientific | Cat. No. BP1302-10 | |||
| Equipments | |||||
| PCR machine | MJ Research | Cat. No. PTG-200 | |||
| Centrifuge | Eppendorf | Cat. No. 5415C | |||
| Water Bath | Precision Scientific | Cat. No. 666A3 | |||
| Gel running instrument | Fisher Scientific | Cat. No. 09-528-165 | |||
| Gel running power supply | Fisher Scientific | Cat. No. 45-000-465 | |||
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | Cat. No. 1708195EDU | |||
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | Cat. No. ND1000 | |||
| C. elegans related1 | 1see reference27 for standard C. elegans culture and maintenance procedures. | ||||
| LB Medium and plates2 | 2see reference24 for protocols. | ||||
| Tryptone | Acros Organics | Cat. no. 611845000 | |||
| Yeast Extract | BD Biosciences | Cat. no. 212750 | |||
| NaCl | Sigma | Cat. no. S7653 | |||
| Bacto Agar | BD Biosciences | Cat. no. 214040 | |||
| Ampicillin | Sigma | Cat. no. A0116 | |||
| Tetracycline | Fisher Scientific | Cat. no. BP912 | |||
| M9 Medium2 | 2see reference24 for protocols. | ||||
| NaCl | Sigma | Cat. no. S7653 | |||
| KH2PO4 | Sigma | Cat. no. P0662 | |||
| Na2HPO4 | Sigma | Cat. no. S7907 | |||
| MgSO4 | Sigma | Cat. no. M2773 | |||
| NGM plates 2 | 2see reference24 for protocols. | ||||
| NaCl | Sigma | Cat. no. S7653 | |||
| Peptone | BD Biosciences | Cat. no. 211677 | |||
| Tryptone | Acros Organics | Cat. no. 611845000 | |||
| Bacto Agar | BD Biosciences | Cat. no. 214040 | |||
| MgSO4 | Sigma | Cat. no. M2773 | |||
| CaCl2 | Sigma | Cat. no. C3881 | |||
| Cholesterol | Sigma | Cat. no. C8667 | |||
| K2HPO4 | Sigma | Cat. no. P3786 | |||
| KH2PO4 | Sigma | Cat. no. P0662 | |||
| RNAi plates3 | 3see reference60 for protocols. | ||||
| NaCl | Sigma | Cat. no. S7653 | |||
| Peptone | BD Biosciences | Cat. no. 211677 | |||
| Tryptone | Acros Organics | Cat. no. 611845000 | |||
| Bacto Agar | BD Biosciences | Cat. no. 214040 | |||
| MgSO4 | Sigma | Cat. no. M2773 | |||
| CaCl2 | Sigma | Cat. no. C3881 | |||
| Cholesterol | Sigma | Cat. no. C8667 | |||
| K2HPO4 | Sigma | Cat. no. P3786 | |||
| KH2PO4 | Sigma | Cat. no. P0662 | |||
| IPTG | US Biological | Cat. no. I8500 | |||
| Carbenicillin | Fisher Scientific | Cat. no. BP2648 | |||
| NaOH | Fisher Scientific | Cat. no. SS266-1 | |||
| Sodium hypochlorite | Fisher Scientific | Cat. no. 50371500 | |||
| Bacteria | |||||
| OP50 bacteria | CGC | ||||
| HT115 bacteria | CGC | ||||
| Genome-wide RNAi libraries | |||||
| Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref29,49) | Source BioScience | ||||
| C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref50) | Source BioScience | ||||
| Imaging related | |||||
| Lidocaine | MP Biomedicals,LLG | Cat. no. 193917 | |||
| Materials | |||||
| Vacuum Grease Silicone | Beckman | Cat. no. 335148 | |||
| Microscope slides | Fisher Scientific | Cat. no. 4448 | |||
| Microscope coverslips (22×22-1） | Fisher Scientific | Cat. no. 12-542-B | |||
| Tissue culture plate, 6 well | Corning Inc. | Cat. no. 08-772-33 | |||
| Equipment | |||||
| SMZ-U dissecting microscope (Nikon) | |||||
| SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions). | |||||
| TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem) | |||||
| C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon) | |||||
Referencias
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