התעלה Excretory C. elegans כמודל עבור מורפוגנזה לומן תאיים ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן בתא יחיד: תיוג על ידי התכה GFP, RNAi אינטראקציה עם המסך הדמיה

Summary

התעלה excretory C. elegans הוא מודל תא בודד ייחודית לניתוח חזותי ויוו של דה נובו מקוטב ממברנה להן. פרוטוקול זה מתאר שילוב של גישות, וישימה זיהוי ואפיון של מולקולות בימוי חד־תאיות tubulogenesis, הפסגה להן קרום ו לומן סטנדרטי גנטי/RNAi והדמיה.

Abstract

התעלות excretory 4 C. elegans הינם צינורות צרים מורחב לכל אורך החיה של תא בודד, עם endotubes תאיים כמעט באותה מידה רחוק מורחב זה לבנות ולייצב את לומן עם קרום, submembraneous שלד התא אופי הפסגה. התא excretory מרחיבה את אורכו כ 2000 פעמים ליצירת תעלות אלו, מכין מודל זה ייחודי להערכה ויוו של דה נובו מקוטב ממברנה להן, מורפוגנזה לומן תאיים ו חד־תאיות tubulogenesis. פרוטוקול המוצגת כאן מראה כיצד לשלב תקן תיוג, רווח, הפסד-של-פונקציה גנטית או התערבות ב RNA (RNAi)-, וגישות מיקרוסקופיים לשימוש מודל זה כדי לנתח באופן חזותי ולנתח באופן פונקציונלי תהליכים אלה ברמה המולקולרית. כדוגמה של גישה תיוג, הפרוטוקול מתאר את הדור של חיות הטרנסגניים עם חלבונים פיוז’ן פלורסנט לניתוח בשידור חי של tubulogenesis. כדוגמה של גישה גנטיים, זה מדגיש את נקודות המפתח של חזותי מבוסס-RNAi אינטראקציה מסך המיועד לשינוי הפנוטיפ רווח-של-הפונקציה לתעלה פיברוזיס. הן השיטות הספציפיות תיאר כיצד: תווית והמחש התעלות בהבעת פלורסנט חלבונים; לבנות ספרייה RNAi יישוב ו אסטרטגיה RNAi הקרנת לניתוח מולקולרית של תעלת מורפוגנזה; מבחינה ויזואלית להעריך שינויים של תעלת פנוטיפים; ציון אותם על ידי לנתח פלורסצנטיות מיקרוסקופ; לאפיין את תעלת subcellular הרכיבים ברזולוציה גבוהה יותר על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית; ולכמת פרמטרים חזותי. הגישה היא שימושית עבור החוקר מעוניין ניצול תעלת excretory C. elegans עבור זיהוי ואפיון גנים המעורבים בתהליכי phylogenetically שנשמרת לומן תאיים ו חד־תאיות מורפוגנזה שפופרת.

Introduction

כל האיברים הפנימיים מורכבים של צינורות, חיונית עבור שלהם פונקציות שונות, כגון תחבורה, חילופי גזים, נוזלים וחומרים מזינים, את הפרשת פסולת מטבולית. אופיים מקוטב, עם ממברנות הפסגה, lumenal ברורים, מותאמת עבור פונקציות ספציפיות אלה, ויש פגמים להן המערכות שלהם אנדו – ואת קרום פלזמה הגורם השכיח של מחלות אנושיות^1,2. הרוב המכריע של צינורות של להערכת ושל האיברים הפנימיים הם multicellular ויוצרים לומן intercellularly; עם זאת, חד־תאיות צינורות, היוצרים לומן intracellularly, ניתן, לדוגמה, לייצג בדיוק כמו 30%-50% של מיטות נימי האנושי². הממברנות מקוטב של רב – וצינורות חד־תאיות דומים בהרכב, למרות microdomains שלהם עשויים להיות שונים בהתבסס על התפקוד המסוים של הצינור (למשל, תעלת excretory canaliculi לעומת microvilli מעיים ב Caenorhabditis elegans; ראה המלווה נייר על tubulogenesis מעיים C. elegans )³. עקרונות להן קרום מקוטב tubulogenesis נשמרים בין metazoans, מכונות מולקולרי דומה ומכוונת אותם^1,2,4.

מערכת excretory C. elegans מורכב של חמישה תאים: תא excretory (EC), צינור תא (DC), הנקבוביות התא (PC) ואת שני תאים בלוטת. אבלציה של EC, DC או PC גורמת להצטברות נוזלים לתוך חלל הגוף ולמות חיות את הפרפרים והעשים מוקדם⁵. מסקרן, אלה שלושה צינורות חד־תאיות ליצור שלהם לומן בשלוש דרכים שונות: על ידי תא הולו (EC); תא גלישת בשילוב עם היווצרות צומת autocellular (PC); על-ידי גלישת תא ביחד עם autofusion (DC); מנגנונים שונים של לומן מורפוגנזה כי הם phylogenetically שנשמרת^6,כל⁷. EC, הממוקם בצד הלטראלי השמאלי של הנורה בלוע האחורי, שולח שתי הרחבות לרוחב אשר התעלות ארבע להתרחב להאריך anteriorly, posteriorly (בצד שני מימין ומשמאל) קצה האף של התולעת וזנב , בהתאמה (איור 1)^5,6,8. EC נמשך כ 1 מיקרומטר 2 x 1,000 מיקרומטר, שהופך אותו התא הגדול ביותר החיה. ברמה subcellular, התעלה excretory הוא צינור פשוטה, המופקים קרום הבסיס מכוונים את pseudocoelom, ואת חפר על ידי קרום lumenal (endotube). קרום lumenal תעלת מתחבר צינור קרום lumenal בצומת רק המערכת שלה; התעלות הן אחרת junctionless לאורך שלהם אורכי (איור 1). קרום lumenal תעלת excretory שלד התא שלו submembraneous הם הפסגה, שהוגדרו על-ידי ההרכב המולקולרי שלהם, הדומה ההרכב של קרום הפסגה, שלד התא submembraneous צינוריות multicellular, כגון המעי, ושל אחרים (למשל, שטוח) epithelia. Organelles cytoplasmic, כולל endosomal vesicular, אחרים (למשל, גולג’י) endomembranes מופצים לאורך התעלה. בנוסף, שלפוחית canalicular מרובים – מחובר ממברנה lumenal, ו/או מחוברים או מבודד – מושחלים דרך תעלת הציטופלסמה^7,8,9,10 . חיבור פלזמה-ממברנה/canalicular דינמי זה עוד יותר מרחיבה את מערכת קרום של התעלה ותורם בשני לומן מורפוגנזה ו- osmoregulation¹⁰. התעלה excretory וכך מורכב כמעט כולו אנדו – ממברנות פלזמה, מתן מודל מצוין עבור הניתוח של קרום מקוטב להן ועל ויסות אנדו-ממשק קרום פלזמה. הרחבה דרמטית של קרום הפסגה במהלך מורפוגנזה תעלת – במערכת זו תא בודד חופפת לומן סיומת – גם מאפשרת לנתח את הבעיות אדריכלי הנובעים על ידי צורך לייצב ובאמצע של הממברנה lumenal תאיים . פרוטוקול זה מתמקדת על הניתוח של מורפוגנזה מבנית של התעלה צינור של לומן, את הדינמיקה ממברנה תאיים הדרושים עבור תהליך זה, ולא על האותות לכוון את התנועות תאים המייצרים בעמדה של EC מערכת excretory ולבנות אתהקשרים מורכב מאלמנטים אחרים התאית (נבדקה ב⁶).

יתרון נוסף של המערכת תעלה תא בודד C. elegans לניתוח של קרום מקוטב, לומן תאיים להן הוא היכולת להפריד, בזמן התפתחותית, הדור של מרכיבים שונים של ממברנות שלה לעיקולים ומעברים. הנציבות האירופית נולד בזמן הסגר הגחון לבין מתיישב ventro-רוחבית של הלוע במהלך אמצע מופרה^5,6,8, שבמהלכן זמן לרוחב התעלה והסיומת מסעף לבצע. זה ואחריו תעלת הקדמי-אחוריים סיומת במהלך מופרה מאוחר, תהליך הנמשך אל תוך L1-הזחל (איור 1). זחל בימיו, הקצה האחורי התעלה מגיע בערך באמצע של התולעת, מלא לכיוון הזנב בסוף השלב L1, לאחר זמן תעלת מאריך יחד עם תולעת⁸. תעלת פעיל הצמיחה במהירות העולה על זה של הצמיחה של החיה ובכך מסתיימת בשלב הזחל הראשון, עם זאת, בהמשך צמיחה מתרחשת במקביל עם הצמיחה של כל החיות הזחל נוספים (L2 – 4). הגדרה זו מספקת את ההזדמנות כדי לנתח שלבים שונים של דה נובו מקוטב להן קרום עצמאית של חלוקת התא מקוטב או העברה. יתר על כן, הוא מאפשר את ההפרדה של תהליך זה מההרכבה של צמתי (אשר מתרחשים העובר לפני תחילתן לומן); דרישה המדויק שלהם בתוך הממברנה קיטוב הוא עדיין שאלה פתוחה בשטח קוטביות. בסופו של דבר, זה ייחודי מפריד הפסגה של התרחבות קרום הבסיס, התהליך האחרון שלפני לשעבר תעלות excretory¹⁰. המודל תעלת excretory C. elegans ולכן הוא מהווה השלמה אינפורמטיבי במיוחד למודל מעיים משתף מספר יתרונות אלה לניתוח של קרום מקוטב להן אך מבוצע זה באווירה multicellular (ראה העיתון הנלווה על מעיים tubulogenesis³).

למרות פראי-סוג תעלות בקוריאנית ודק במיוחד בתולעת קטנה זו, לומן שלהם יכול להיות השישיsualized ישירות על-ידי Nomarski אופטיים בחיה שקוף. למעשה, ניתן לאפיין מורפולוגיות תעלת פיברוזיס המוטציות בבעלי ללא תווית באמצעות הגדלה נמוכה לנתח מיקרוסקופ, אשר שימש אפקט נהדר במסכים גנטי קדימה כדי לזהות גנים המעורבים tubulogenesis¹¹. ויזואליזציה משופרת של המורפולוגיה של תעלות, ההבחנה של הקרומים מקוטב שלהם, רכיבי cytoskeletal, organelles תאיים שונים ומבנים אחרים subcellular, עם זאת, דורש תיוג, גבוה יותר כוח פלורסנט ויבתר ו קונאפוקלית מיקרוסקופ. למרות המבנה הדק של התעלות מציב מספר קשיים על תיוג, מיקרוסקופ, ממברנות ורכיבים subcellular ניתן להבחין דרך ייחודית כל תא מולקולות ספציפיות, בעלי חיים יכול להיות בבטחה מותקן עבור מיקרוסקופ אם זהירות מסויימים נלקחים כדי למנוע החדרת חפצים (ראה פרוטוקול של דיון). תיוג יכול להיעשות אימונוהיסטוכימיה בדגימות קבוע, או על ידי יצירת תולעים הטרנסגניים המבטאים חלבונים פיוז’ן פלורסנט תחת השליטה של משלהם או excretory היזמים תעלת ספציפי עבור הדמיה ויוו . פרוטוקול זה מתאר את שיטת תיוג האחרון (ראה את העיתון הנלווה tubulogenesis מעיים עבור נוגדן מכתים³).

היכולת לשלב ויוו הפסד או רווח-של-פונקציה לימודים עם ויוו הדמיה האנליזה התא הבודד רמה לאורך כל גורם פיתוח התעלה excretory C. elegans מודל חזק במיוחד מולקולרית ו ניתוח הסלולר של חד־תאיות tubulogenesis. קדימה או אחורה מסכי גנטי יכול להתבצע החל חיה הטרנסגניים פראי-סוג או שכותרתו לזהות תעלת מורפוגנזה פנוטיפים (למשל, ציסטות) פגמים הגן הבסיסי שלהם. לחלופין, מסכי כזה ניתן להתחיל עם הפנוטיפ המוטנטי (למשל, תעלה פיברוזיס), לזהות מדכאי או משפרי של פנוטיפ זה לזיהוי גנים המקיימים אינטראקציה פונקציונלית עם הגן הגורם של פנוטיפ מוטציה. הפגם הגנטי גורם של פנוטיפ מוטציה יכולה לגרום לאובדן (למשל, via -ג’ין מחיקה) או רווח (למשל, באמצעות מוטציה הפעלת או דרך המבוא של ג’ין עודף עותקים) של הפונקציה ובדוקים. מוטגנזה מכוונת קדימה או מסכי RNAi שיטתית ללא דעות קדומות על תפקוד הגן, מאפשרות זיהוי גנים המעורבים בפונקציה של עניין לא משוחדת. לאור זמינותו של ברמת הגנום RNAi האכלה ספריות, כמעט בכל גן יכול להיות בקלות הפיל ידי RNAi ב- C. elegans, כך גנטית יחיד בכל עניין או כל קבוצה של גנים (למשל, במסכים יישוב) יכול גם להיות במהירות ובחן על השפעתם בגישה הפוכה גנטיקה. להפגין שילוב אפשרי של גישות, כאן נתאר מסך יישוב אינטראקציה RNAi, החל מוטנט רווח-של-הפונקציה לתעלה excretory פיברוזיס, המסומנת חלבון פלואורסצנטי ירוק cytoplasmic התעלה (GFP). פנוטיפ מוטציה נוצר על ידי ביטוי של אמ-1, שנשמרת מאוד C. elegans ortholog של משפחת מקשר ממברנה-אקטין אזרין-Radixin-Moesin (ERM), אשר היה מעורב מורפוגנזה לומן, ממברנה ארגון מינים רבים¹². C. elegans ERM-1. רגישה לממברנות lumenal של איברים פנימיים, כגון excretory תעלת המעי, ו נדרש עבור לומן היווצרות שני¹³. ביטוי ERM-1 מגייס אקטין עודף ושלפוחיות על קרום תעלת lumenal, הגדלת השטף לתוך לומן, הפקת תעלה פיברוזיס קצר ואת קרום lumenal הכיווץ אקטין מעובה פרווה⁹. הפרוטוקול מתאר כיצד ליצור זנים הטרנסגניים עם excretory הביע תעלת שכותרתו פיוז’ן חלבונים (או חלבונים אחרים); כיצד לבצע יישוב מסכי RNAi החל זנים כאלה, כדי לזהות מודיפיקטורי הפנוטיפ התעלה; ואיך לנתח את התוצאות של מסכים כאלה באופן חזותי באמצעות מיקרוסקופ ויבתר ו קונאפוקלית פלורסצנטיות, כולל דרכים פשוטות כדי לכמת פנוטיפים tubulogenesis אינפורמטיבי. ניתן למצוא חלופה תיוג הפרטים של RNAi, התרגלו הגנים tubulogenesis לעתים מזומנות קטלנית, וטכניקות בעיתון הנלווה על מעיים tubulogenesis³. כל השיטות יכול לשמש בשילובים שונים עבור החקירה של שאלות נוספות על תעלת tubulogenesis.

Protocol

1. תיוג התעלה Excretory C. elegans מאת חלבונים פיוז’ן פלורסנט 14 הערה: לראות את הנייר הנלווה על מעיים tubulogenesis 3 סימון על-ידי בחיי עיר נוגדן מכתים הליכים ומצוידת התעלה excretory. ראו טבלה 1 לדוגמאות של מולקולות הוכח שימושית ליצירת אפקטים של C. eleg…

Representative Results

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש התעלות excretory C. elegans חזותי, מולקולרי לניתוח tubulogenesis חד־תאיות ו לומן תאיים מורפוגנזה בתא יחיד. במהלך השלוחה שלהם מימי אמצע מופרה לבגרות, התעלות excretory ארבע ממשיכים להרחיב שלהם basolateral וממברנות הפסגה/lumenal יחד עם שלהם canalicular endosomal endomembrane מערכת, מת…

Discussion

רב-תכליתיות גנטי של C. elegans , שקיפות, תוכנית פשוטה גוף וכל השושלת הקבועה תא שרד מודל מצוין עבור הניתוח של מורפוגנזה פרוטוקול זה מתאר כיצד לשלב מניפולציות גנטיות סטנדרטי הדמיה מחקרים כדי לנצל 2 מיקרון דק C. elegans תעלות excretory ללמוד ממברנה מקוטב ו לומן תאיים להן בשפופרת תא בודד.

<p class="jove…

Materials

Cloning
Plasmid pPD95.75	Addgene	Cat. No. 37464
PCR Kit	Qiagen	Cat. No. 27106
Ligation kit	New England Biolabs	Cat. No. E2611L
DNA marker	Thermo Scientific	Cat. No. SM1331
Agarose DNA grade	Fisher Scientific	Cat. No. BP164-100
Competent cells	New England Biolabs	Cat. No. C2987H
Tris	Fisher Scientific	Cat. No. BP154-1
EDTA	Sigma	Cat. No. ED-1KG
Acetic acid	Fisher Scientific	Cat. No. A38S-500
Ethidium bromide	Fisher Scientific	Cat. No. BP1302-10
Equipments
PCR machine	MJ Research	Cat. No. PTG-200
Centrifuge	Eppendorf	Cat. No. 5415C
Water Bath	Precision Scientific	Cat. No. 666A3
Gel running instrument	Fisher Scientific	Cat. No. 09-528-165
Gel running power supply	Fisher Scientific	Cat. No. 45-000-465
Molecular Imager Gel Doc XR System	Bio-Rad	Cat. No. 1708195EDU
Nanodrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	Cat. No. ND1000
C. elegans related1			1see reference27 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates2			2see reference24 for protocols.
Tryptone	Acros Organics	Cat. no. 611845000
Yeast Extract	BD Biosciences	Cat. no. 212750
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
Bacto Agar	BD Biosciences	Cat. no. 214040
Ampicillin	Sigma	Cat. no. A0116
Tetracycline	Fisher Scientific	Cat. no. BP912
M9 Medium2					2see reference24 for protocols.
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
KH2PO4	Sigma	Cat. no. P0662
Na2HPO4	Sigma	Cat. no. S7907
MgSO4	Sigma	Cat. no. M2773
NGM plates 2			2see reference24 for protocols.
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
Peptone	BD Biosciences	Cat. no. 211677
Tryptone	Acros Organics	Cat. no. 611845000
Bacto Agar	BD Biosciences	Cat. no. 214040
MgSO4	Sigma	Cat. no. M2773
CaCl2	Sigma	Cat. no. C3881
Cholesterol	Sigma	Cat. no. C8667
K2HPO4	Sigma	Cat. no. P3786
KH2PO4	Sigma	Cat. no. P0662
RNAi plates3			3see reference60 for protocols.
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
Peptone	BD Biosciences	Cat. no. 211677
Tryptone	Acros Organics	Cat. no. 611845000
Bacto Agar	BD Biosciences	Cat. no. 214040
MgSO4	Sigma	Cat. no. M2773
CaCl2	Sigma	Cat. no. C3881
Cholesterol	Sigma	Cat. no. C8667
K2HPO4	Sigma	Cat. no. P3786
KH2PO4	Sigma	Cat. no. P0662
IPTG	US Biological	Cat. no. I8500
Carbenicillin	Fisher Scientific	Cat. no. BP2648
NaOH	Fisher Scientific	Cat. no. SS266-1
Sodium hypochlorite	Fisher Scientific	Cat. no. 50371500
Bacteria
OP50 bacteria	CGC
HT115 bacteria	CGC
Genome-wide RNAi libraries
Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref29,49)	Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref50)	Source BioScience
Imaging related
Lidocaine	MP Biomedicals,LLG	Cat. no. 193917
Materials
Vacuum Grease Silicone	Beckman	Cat. no. 335148
Microscope slides	Fisher Scientific	Cat. no. 4448
Microscope coverslips (22×22-1）	Fisher Scientific	Cat. no. 12-542-B
Tissue culture plate, 6 well	Corning Inc.	Cat. no. 08-772-33
Equipment
SMZ-U dissecting microscope (Nikon)
SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions).
TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem)
C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon)