Il canale di Excretory c. elegans come un modello per intracellulare Lumen morfogenesi e biogenesi di membrana polarizzata In Vivo in una singola cella: etichettatura di GFP-fusioni, schermata di interazione di RNAi e Imaging
Summary
Il canale escretore di c. elegans è un modello unico di singola cellula per l’analisi visiva in vivo della biogenesi della membrana de novo polarizzato. Questo protocollo descrive una combinazione di standard genetico/RNAi e approcci, adattabili per l’identificazione e la caratterizzazione di molecole dirigere tubulogenesis unicellulari e biogenesi lumen e membrana apicale di imaging.
Abstract
I quattro canali escretori c. elegans sono tubi stretti estese attraverso la lunghezza dell’animale da una singola cellula, con quasi altrettanto lontano estesa endotubes intracellulare che costruiscono e stabilizzare il lume con una membrana e submembraneous citoscheletro di carattere apicale. La cella escretore si espande la sua lunghezza circa 2.000 volte per generare questi canali, rendendo questo modello unico per la valutazione in vivo della biogenesi di membrana de novo polarizzato, morfogenesi lumen intracellulare e unicellulari tubulogenesis. Il protocollo presentato qui illustra come combinare standard di etichettatura, guadagno e perdita di-funzione genetica o interferenza del RNA (RNAi)-e approcci al microscopio per utilizzare questo modello per sezionare visivamente e funzionalmente analizzare questi processi a livello molecolare. Come esempio di un approccio d’etichettatura, il protocollo delinea la generazione di animali transgenici con proteine di fusione fluorescenti per analisi live di tubulogenesis. Come esempio di un approccio genetico, accentua i punti chiave di un visual schermo di interazione basato su RNAi progettato per modificare un fenotipo di guadagno di funzione canale cistico. I metodi specifici descritti sono come: etichetta e visualizzare i canali di esprimere proteine fluorescenti; costruire una libreria di RNAi mirata e strategize RNAi di screening per l’analisi molecolare della morfogenesi canal; valutare visivamente le modifiche di fenotipi di canale; Punteggio loro dissecando microscopia di fluorescenza; caratterizzare le componenti sottocellulari canal a risoluzione superiore mediante microscopia confocale; e quantificare i parametri visual. L’approccio è utile per l’investigatore che è interessato a sfruttare il canale escretore di c. elegans per identificare e caratterizzare geni coinvolti nei processi filogeneticamente conservati del lumen intracellulare e unicellulari morfogenesi del tubo.
Introduction
Tutti gli organi interni sono composti da tubi, cruciale per loro molte funzioni diverse, come ad esempio il trasporto e scambio di gas, liquidi e sostanze nutritive e l’escrezione dei rifiuti metabolici. Loro carattere polarizzato, con membrane apicali e lumenal distinte, è adattato a queste specifiche funzioni, e difetti nella biogenesi dei loro sistemi endo – e della membrana plasmatica sono una causa frequente di malattia umana1,2. La maggior parte dei tubi del sistema vascolare e degli organi interni è pluricellulare e forma un lume intercellularmente; Tuttavia, tubi unicellulari, che formano il lume intracellulare, possono, ad esempio, rappresentare tanto quanto 30 – 50% dei letti capillari umano2. Le membrane polarizzate di multi – e tubi unicellulari sono simili nella composizione, anche loro microdomini possono differire in base alla funzione specifica del tubo (ad es., canaliculi canale escretore contro i microvilli intestinali in Caenorhabditis elegans; Vedi che accompagna il libro su c. elegans intestinale tubulogenesis)3. I principi della biogenesi della membrana polarizzata e tubulogenesis sono conservati tra i metazoi, e un simile macchinario molecolare li dirige1,2,4.
Il sistema escretore di c. elegans è costituito da cinque celle: poro escretore delle cellule (CE), delle cellule del condotto (DC), cellulare (PC) e due cellule della ghiandola. Ablazione del CE, DC o PC provoca l’accumulo di liquidi nella cavità del corpo e animali muoiono un precoce stadio larvale di5. Curiosamente, questi tre tubi unicellulari creano loro lumi in tre modi diversi: dalla cella di vuotatura (CE); avvolgimento di cellulare accoppiato con formazione di giunzione di autocellular (PC); e avvolgendo cellulare accoppiato con autofusion (DC); diversi meccanismi della morfogenesi lumen che sono tutti filogeneticamente conservate6,7. La CE, situata sul lato sinistro laterale del bulbo pharyngeal posteriore, manda due estensioni laterali da cui si diramano i quattro canali estendere anteriormente e posteriormente (su entrambi i lati destro e sinistro) per la punta del naso del verme e coda , rispettivamente (Figura 1)5,6,8. La CE si estende da circa 1 µm a 2 x 1.000 µm, rendendo la cellula più grande nell’animale. A livello subcellulare, il canale escretore è un semplice tubo, generato da una membrana basale diretto verso il pseudocoelom e incanalato da una membrana di lumenal (endotube). La membrana di lumenal canal si connette alla membrana lumenal condotto alla sua giunzione solo intercellulare; i canali sono altrimenti junctionless lungo la loro lunghezza (Figura 1). La membrana di lumenal canale escretore e sua submembraneous citoscheletro sono apicali, definito dalla loro composizione molecolare che ricorda la composizione della membrana apicale e citoscheletro submembraneous di tubi pluricellulari, come l’intestino, e di altri epiteli (ad es., piatto). Organelli citoplasmici, tra cui endosomal vescicolare e altri (ad es., Golgi) livello delle endomembrane è distribuiti lungo la lunghezza del canale. Inoltre, più vescicole canalicular – collegato alla membrana lumenal, e/o interconnessi o isolato – sono filettate attraverso il canale citoplasma7,8,9,10 . Questa connessione dinamica del plasma-membrana/canalicular ulteriormente espande il sistema a membrana del canale e contribuisce a entrambi di morfogenesi e osmoregolazione del lume10. Il canale escretore pertanto costituito quasi interamente endo – e membrane plasmatiche, fornendo un eccellente modello per l’analisi della biogenesi della membrana polarizzata e la regolazione della endo-all’interfaccia della membrana plasmatica. La drammatica espansione della membrana apicale durante la morfogenesi di canal – in questo sistema di cella singola coincida con estensione lumen – permette anche di analizzare i problemi architettonici derivanti dalla necessità di stabilizzare e centrare una membrana di lumenal intracellulare . Questo protocollo si concentra sull’analisi della morfogenesi strutturale di canale tubo e di lumen e le dinamiche di membrana intracellulare necessarie per questo processo, piuttosto che sui segnali che indirizzano i movimenti delle cellule che generano la posizione della CE nella sistema escretore e costruire i suoi intricati collegamenti ad altri elementi cellulari (rivisto in6).
Un ulteriore vantaggio del sistema di c. elegans unicellulare canal per l’analisi della membrana polarizzata e biogenesi lumen intracellulare è la sua capacità di separare, nel tempo inerente allo sviluppo, la generazione delle diverse componenti della sue membrane e giunzioni. La CE è nato al momento della chiusura ventrale e si deposita ventro-laterale della faringe durante metà embriogenesi5,6,8, durante il quale si verificano tempo canale laterale estensione e ramificazione. Questo è seguito dall’estensione antero-posteriore canale durante l’embriogenesi tardiva, un processo che continua nella fase L1-larvale (Figura 1). In una larva appena schiusi, la punta posteriore del canale raggiunge circa la metà del worm, completamente estendere a coda alla fine della fase L1, dopo di che il canale si allunga con il verme8. Crescita attiva canale ad una velocità superiore a quella della crescita dell’animale così si conclude la prima fase larvale, tuttavia, ulteriore crescita avviene in parallelo con la crescita dell’intero animale durante gli stadi larvali aggiuntive (L2 – 4). Questa impostazione offre l’opportunità di analizzare diversi passaggi della biogenesi di membrana de novo polarizzata indipendente di divisione delle cellule polarizzata o migrazione. Inoltre, permette la separazione di questo processo dall’assemblaggio di raccordi (che si verificano nell’embrione prima dell’inizio di lumen); loro esigenza esatta nella polarizzazione di membrana è ancora una questione aperta nel campo di polarità. Infine, si separa in modo univoco apicale dall’espansione di membrana basale, il processo di quest’ultimo precede l’ex nei canali escretori10. Il modello di canale escretore elegans del c. è quindi un complemento particolarmente istruttivo al modello intestinale che condivide un certo numero di questi vantaggi per l’analisi della biogenesi della membrana polarizzata, ma viene eseguito in un ambiente multicellulare (Vedi il libro d’accompagnamento sul tubulogenesis intestinale3).
Anche se selvaggio-tipo canali sono tubuli ultrasottili in questo minuscolo verme, loro lumi possono essere visualized direttamente dall’ottica di Nomarski in questo animale trasparente. Infatti, morfologie mutante canale cistico possono essere caratterizzate in animali senza etichetta usando l’ingrandimento basso microscopia, che è stato utilizzato con grande efficacia in avanti schermi genetici per identificare i geni coinvolti nella tubulogenesis11di dissezione. Visualizzazione migliore della morfologia dei canali e distinzione delle loro membrane polarizzate, componenti citoscheletriche, diversi organelli intracellulari e altre strutture subcellulari, tuttavia, richiede etichettatura e maggiore potenza fluorescenti microscopia confocale e dissezione. Anche se la struttura fine dei canali pone una serie di difficoltà per l’etichettatura e la microscopia, membrane e componenti sottocellulari possono essere distinto tramite le molecole specifiche univoche per ogni vano, e gli animali possono essere montati in modo sicuro per microscopia se alcune precauzioni per evitare di introdurre artefatti (Vedi protocollo e discussione). Etichettatura può essere fatto mediante immunoistochimica nei campioni fissati, o generando vermi transgenici che esprimono le proteine di fusione fluorescenti sotto il controllo dei loro propri o escretori canal specifici promotori per l’imaging in vivo . Questo protocollo descrive la seconda tecnica di etichettatura (Vedi il documento di accompagnamento il tubulogenesis intestinale per anticorpo che macchia3).
La capacità di combinare in vivo studi perdita o guadagno di funzione con in vivo imaging analisi a singola cella di livello in tutto lo sviluppo rende il canale escretore di c. elegans un modello particolarmente forte per il molecolare e analisi cellulare del tubulogenesis unicellulari. Marcia avanti o retromarcia schermi genetici possono essere eseguiti a partire con un animale transgenico wild-type o con etichettato per identificare il canale morfogenesi fenotipi (per esempio, cisti) e loro difetti del gene sottostante. In alternativa, tali schermi possono iniziare con un fenotipo mutante (ad esempio, un canale cistico) e identificare soppressori o esaltatori di questo fenotipo per identificare i geni che interagiscono funzionalmente con il gene che causa il fenotipo mutante. Il difetto genetico che causa il fenotipo mutante può indurre una perdita (ad es., tramite omissione del gene) o un aumento (ad es., tramite una mutazione d’attivazione o tramite l’introduzione di copie del gene in eccesso) della funzione oggetto dell’inchiesta. Trasmettere la mutagenesi o RNAi sistematica schermi senza preconcetti sulla funzione del gene e permettano l’identificazione imparziale di geni coinvolti nella funzione di interesse. Data la disponibilità di RNAi genoma librerie di alimentazione, quasi ogni gene può essere facilmente abbattuto da RNAi in c. elegans, tale che ogni singolo gene di interesse o qualsiasi gruppo di geni (ad es., nelle schermate mirati) anche può essere rapidamente sondato per il loro effetto in un approccio di genetica inversa. Per dimostrare una possibile combinazione di approcci, descriviamo qui una schermata di interazione RNAi mirata, a partire con un mutante di guadagno di funzione cistica canale escretore, etichettati con la proteina fluorescente citoplasmico canale verde (GFP). Il fenotipo mutante è stato generato da una sovraespressione di erm-1, un altamente conservata di c. elegans ortholog della famiglia del linker membrana-actina ezrina-radixina-moesina (ERM), che è stato implicato nella morfogenesi del lume e della membrana organizzazione in molte specie12. C. elegans ERM-1 si localizza lumenal membrane degli organi interni, come ad esempio il canale escretore e intestino ed è necessario per la formazione di lumen in sia13. Sovraespressione di ERM-1 recluta actina in eccesso e vescicole alla membrana lumenal del canale, aumentando il flusso nel lumen e generando un breve canale cistico e una membrana di lumenal aggraffata con actina ispessita sottopelo9. Il protocollo descrive come generare ceppi transgenici con escretivo-canal-espresso etichettato proteine di fusione (o altre proteine); come eseguire mirati schermi RNAi a partire con tali ceppi, per identificare i modificatori di un fenotipo di canale; e come analizzare visivamente i risultati di tali schermi di dissezione e confocale microscopia a fluorescenza tra cui semplici modi per quantificare tubulogenesis informativo fenotipi. Alternativa i dettagli del RNAi, regolato per i geni di tubulogenesis spesso letale e tecniche di etichettatura si trovano nel libro d’accompagnamento sulla tubulogenesis intestinale3. Tutti i metodi possono essere utilizzati in varie combinazioni per l’indagine sulle altre domande sul canale tubulogenesis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Versatilità genetica c. elegans , trasparenza, piano corpo semplice e stirpe delle cellule invarianti tutti ne fanno un eccellente modello per l’analisi della morfogenesi. Questo protocollo viene descritto come combinare standard manipolazioni genetiche e imaging studi per poter sfruttare il 2 micron sottile c. elegans canali escretori per studiare membrana polarizzata e biogenesi intracellulare lumen in un tubo di singola cellula.
Etichettatura
I canali …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo M. Buechner (Università del Kansas, Kansas, USA), K. Nehrke (University of Rochester Medical Center, Rochester, New York, USA) e il centro di genetica di Caenorhabditis , finanziato dal National Institutes of Health, ufficio di infrastrutture di ricerca Programmi (P40 OD010440). Quest’opera è stata sostenuta da sovvenzioni NIH GM078653, MGH è 224570 e SAA 223809 a V.G.
Materials
| Cloning | |||||
| Plasmid pPD95.75 | Addgene | Cat. No. 37464 | |||
| PCR Kit | Qiagen | Cat. No. 27106 | |||
| Ligation kit | New England Biolabs | Cat. No. E2611L | |||
| DNA marker | Thermo Scientific | Cat. No. SM1331 | |||
| Agarose DNA grade | Fisher Scientific | Cat. No. BP164-100 | |||
| Competent cells | New England Biolabs | Cat. No. C2987H | |||
| Tris | Fisher Scientific | Cat. No. BP154-1 | |||
| EDTA | Sigma | Cat. No. ED-1KG | |||
| Acetic acid | Fisher Scientific | Cat. No. A38S-500 | |||
| Ethidium bromide | Fisher Scientific | Cat. No. BP1302-10 | |||
| Equipments | |||||
| PCR machine | MJ Research | Cat. No. PTG-200 | |||
| Centrifuge | Eppendorf | Cat. No. 5415C | |||
| Water Bath | Precision Scientific | Cat. No. 666A3 | |||
| Gel running instrument | Fisher Scientific | Cat. No. 09-528-165 | |||
| Gel running power supply | Fisher Scientific | Cat. No. 45-000-465 | |||
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | Cat. No. 1708195EDU | |||
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | Cat. No. ND1000 | |||
| C. elegans related1 | 1see reference27 for standard C. elegans culture and maintenance procedures. | ||||
| LB Medium and plates2 | 2see reference24 for protocols. | ||||
| Tryptone | Acros Organics | Cat. no. 611845000 | |||
| Yeast Extract | BD Biosciences | Cat. no. 212750 | |||
| NaCl | Sigma | Cat. no. S7653 | |||
| Bacto Agar | BD Biosciences | Cat. no. 214040 | |||
| Ampicillin | Sigma | Cat. no. A0116 | |||
| Tetracycline | Fisher Scientific | Cat. no. BP912 | |||
| M9 Medium2 | 2see reference24 for protocols. | ||||
| NaCl | Sigma | Cat. no. S7653 | |||
| KH2PO4 | Sigma | Cat. no. P0662 | |||
| Na2HPO4 | Sigma | Cat. no. S7907 | |||
| MgSO4 | Sigma | Cat. no. M2773 | |||
| NGM plates 2 | 2see reference24 for protocols. | ||||
| NaCl | Sigma | Cat. no. S7653 | |||
| Peptone | BD Biosciences | Cat. no. 211677 | |||
| Tryptone | Acros Organics | Cat. no. 611845000 | |||
| Bacto Agar | BD Biosciences | Cat. no. 214040 | |||
| MgSO4 | Sigma | Cat. no. M2773 | |||
| CaCl2 | Sigma | Cat. no. C3881 | |||
| Cholesterol | Sigma | Cat. no. C8667 | |||
| K2HPO4 | Sigma | Cat. no. P3786 | |||
| KH2PO4 | Sigma | Cat. no. P0662 | |||
| RNAi plates3 | 3see reference60 for protocols. | ||||
| NaCl | Sigma | Cat. no. S7653 | |||
| Peptone | BD Biosciences | Cat. no. 211677 | |||
| Tryptone | Acros Organics | Cat. no. 611845000 | |||
| Bacto Agar | BD Biosciences | Cat. no. 214040 | |||
| MgSO4 | Sigma | Cat. no. M2773 | |||
| CaCl2 | Sigma | Cat. no. C3881 | |||
| Cholesterol | Sigma | Cat. no. C8667 | |||
| K2HPO4 | Sigma | Cat. no. P3786 | |||
| KH2PO4 | Sigma | Cat. no. P0662 | |||
| IPTG | US Biological | Cat. no. I8500 | |||
| Carbenicillin | Fisher Scientific | Cat. no. BP2648 | |||
| NaOH | Fisher Scientific | Cat. no. SS266-1 | |||
| Sodium hypochlorite | Fisher Scientific | Cat. no. 50371500 | |||
| Bacteria | |||||
| OP50 bacteria | CGC | ||||
| HT115 bacteria | CGC | ||||
| Genome-wide RNAi libraries | |||||
| Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref29,49) | Source BioScience | ||||
| C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref50) | Source BioScience | ||||
| Imaging related | |||||
| Lidocaine | MP Biomedicals,LLG | Cat. no. 193917 | |||
| Materials | |||||
| Vacuum Grease Silicone | Beckman | Cat. no. 335148 | |||
| Microscope slides | Fisher Scientific | Cat. no. 4448 | |||
| Microscope coverslips (22×22-1） | Fisher Scientific | Cat. no. 12-542-B | |||
| Tissue culture plate, 6 well | Corning Inc. | Cat. no. 08-772-33 | |||
| Equipment | |||||
| SMZ-U dissecting microscope (Nikon) | |||||
| SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions). | |||||
| TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem) | |||||
| C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon) | |||||
Referencias
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