Méthodes alternatives In Vitro pour la détermination de l’intégrité structurale de la capside virale
Summary
Méthodes de détection courantes utilisant l’amplification du génome viral sont limités par leur incapacité de discriminer infectieuses de particules non infectieuses. Le but de cet article est de fournir des protocoles détaillés pour des méthodes alternatives aider à la discrimination des particules infectieuses norovirus à l’aide de la liaison aptamère, diffusion dynamique de la lumière et microscopie électronique à transmission.
Abstract
Les norovirus humains exige considérablement la santé publique et pertes économiques dans le monde entier. Émergents en vitro culture avances ne sont pas encore applicables pour la détection systématique du virus. La détection du courant et les techniques de quantification, qui reposent principalement sur l’amplification des acides nucléiques, ne soient pas distinguent infectieuses de particules virales non infectieuses. Le but de cet article est de présenter des détails spécifiques sur les progrès récents dans les techniques utilisées ensemble afin d’obtenir davantage d’informations sur l’état de l’infectiosité des particules virales. Une technique consiste à évaluer la liaison d’un aptamère d’ADNsb norovirus à capsides. Aptamères ont l’avantage d’être facilement synthétisé et modifié et sont peu coûteux et stable. Une autre technique, dynamic light scattering (DLS), présente l’avantage d’observer le comportement de la capside en solution. La microscopie électronique permet pour la visualisation de l’intégrité structurale de le capsides virales. Bien que prometteurs, il y a quelques inconvénients de chaque technique, telles qu’aptamère non spécifiques à la liaison aux molécules chargées positivement de matrices de prélèvement, exigence de capside purifiée pour DLS et une sensibilité médiocre pour la microscopie électronique. Néanmoins, lorsque ces techniques sont utilisées en combinaison, le corps des données produites fournit des informations plus complètes sur l’intégrité de capside des norovirus qui peut être utilisée pour déduire l’infectiosité, information qui est essentielle pour une évaluation précise des Méthodes d’inactivation ou de l’interprétation de détection de virus. Cet article fournit des protocoles permettant d’utiliser ces méthodes pour discriminer les particules infectieuses norovirus humain.
Introduction
Norovirus humain est responsable d’un fardeau considérable de santé publique dans le monde, provoquant des maladies environ 685 millions et 212 000 décès chaque année1, à un coût en milliards de dollars2,3. Aujourd’hui, dosage et détection des norovirus implique l’amplification du génome et/ou plates-formes ligand. Le premier est généralement privilégié car il est plus sensible, fournit des renseignements quantitatifs et a généralement moins de risques de faux positifs4. Technique la plus courante norovirus détection et la quantification du génome amplification est la réaction en chaîne polymérase quantitative de la transcriptase inverse (RT-qPCR). Parce qu’il vise et amplifie un petit segment du génome humain norovirus, RT-qPCR seul n’est pas capable de distinguer les infectieuses et particules non infectieuses, comme l’ARN génomique gratuit, endommageant capsides contenant les génomes et capsides avec mortellement génomes muté/tronqué peuvent encore être amplifiées par RT-qPCR. Alors que deux nouveaux in vitro des techniques culturales pour norovirus humain5,,6 ont été signalés récemment, tous les deux encore s’appuient sur la RT-qPCR pour la quantification des virus et ne sont pas encore des méthodes de routine clinique/environnement tests pour les norovirus humains. Ainsi, la RT-qPCR demeure l’étalon-or pour les essais cliniques sur l’environnement.
Autres méthodes in vitro ont été développés afin de mieux estimer le statut infectieux des particules de norovirus. Ces méthodes peuvent être généralement classés comme ceux qui portent sur l’intégrité de la capside des norovirus et ceux évaluant l’intégrité du génome. La première approche est plus populaire. Une méthode couramment utilisée est le prétraitement RNase avant l’extraction de l’ARN génomique viral, mais cela ne tient pas compte des particules virales qui restent intactes, mais n’ont pas la capacité de lier les récepteurs/co-facteurs de l’hôte, ainsi que les particules virales qui ont muté mortellement ou ont tronqué ou légèrement endommagé génomes7. Intégrité de capside peut également être évaluée basés sur la capacité du virus à se lier aux norovirus humains co-récepteur/co-facteurs, qui est des glucides appelés antigènes de groupe de histo-sang (HBGAs). HBGAs sont présents dans les cellules épithéliales intestinales hôte dans le cadre des glycoprotéines ou glycolipides (parmi de nombreux autres tissus) et peuvent être sécrétées dans les fluides corporels comme la salive. Les bactéries entériques contenant des substances de type HBGA sur leurs surfaces ont également montrés pour lier les norovirus humains8,9,10, et ces interactions peuvent promouvoir des norovirus infection5. Le concept de base de l’utilisation de la liaison de HBGA est que seules des particules virales capables de lier le putatif du récepteur/co-factor serait capables d’infecter les cellules. Plusieurs études suggèrent que la liaison de HBGA axée sur la perle qui précède l’amplification des acides nucléiques est une méthode prometteuse pour l’infectivité discrimination11,12,13,14, 15,16. Un défi majeur au sujet de la HBGAs, c’est qu’aucun type HBGA unique ne peut lier tous les génotypes de norovirus humain. Pour y remédier, mucines gastrique, qui contient HBGAs, a été utilisé à la place des glucides HBGA purifiés dans l’intérêt de la facilité de synthèse, la cohérence et coût réduit.
Une publication récente de Moore et al. 17 a présenté un ensemble de nouvelles techniques d’estimation des norovirus humains intégrité de capside. À la place de HBGAs, Moore et al. 17 a étudié la liaison d’a globalement réactif acide nucléique aptamère (M6-2)18 et globalement réactif anticorps monoclonal (NS14)19 au traité thermiquement capsides de norovirus GII.4 Sydney (Pseudo-particules virales ou PPV) et comparait cette pour la liaison à HBGAs synthétiques. Aptamères nucléotidiques sont courtes (~ 20-80 nt) unique échoués des acides nucléiques (ADN simple brin ou ARN) qui incorporer des structures tridimensionnelles uniques en raison de leur séquence et lier une cible. Parce qu’ils sont des acides nucléiques, ils sont moins coûteux ; facilement chimiquement synthétisés, purifiée et modifiée ; et à la chaleur. Plusieurs rapports d’aptamères générés contre le norovirus existent, avec certains d’entre eux montrant large réactivité à une variété de souches18,20,21,22. A titre d’exemple, Moore et al. 17 a démontré qu’aptamère M6-2 lié à norovirus humains purifiés, assemblé capsides (VLP) et se sont comportés de la même façon à HBGA dans le recours à la capside virale pour maintenir la structure de la protéine ordre (p. ex., secondaire et tertiaire) plus élevée pour liaison de se produire. En revanche, une proportion significative de liaison VLP norovirus à anticorps NS14 resta après que capsides ont été complètement dénaturés. Évaluation de la liaison de norovirus dans l’étude de Moore et al. 17 a été réalisée selon une méthode simple, axée sur la plaque similaire à ELISA, à l’exception que les aptamères sont utilisés à la place de l’anticorps (d’où la méthode a été appelée ELASA). Cette méthode expérimentale à haut débit a été utilisée pour évaluer les effets des différents traitements sur la capside des norovirus, travail qui est utile pour comprendre le mécanisme d’inactivation virale lors de l’exposition aux facteurs de stress physiques ou chimiques. Cependant, un inconvénient de cette méthode est la plus faible sensibilité et manque de tolérance pour les contaminants associés à matrice à des niveaux supérieurs qui causent les liaisons non spécifiques par aptamères.
Moore et al. 17 a utilisé une autre méthode, diffusion de lumière dynamique (DLS), pour surveiller l’agrégation des particules virales en réponse à un traitement thermique. DLS est couramment utilisée pour évaluer la taille des nanoparticules suspensions et a été étendue aux protéines23,virus et24 25,26,27. L’intensité de la lumière diffusée par les particules en solution fluctue en fonction de la taille des particules, permettant le calcul du coefficient de diffusion, puis diamètre des particules à l’aide de formules bien établies. La technique DLS peut distinguer le diamètre hydrodynamique des particules dispersées à l’échelle nanométrique, qui permet de détecter des virus dispersées, protéines de la capside individuels ou dimères et agrégats de virus basés sur la taille27. Agrégation de virus, représentée par une augmentation de la taille des particules, est révélateur de la perte d’intégrité de la capside. La capside est dénaturée et perturbée de sa structure, résidus hydrophobes deviennent exposées et entraîner les particules à se serrer les coudes et forment des agrégats. Listes de distribution peut être utilisé pour mesurer la taille des particules après un traitement précis ou la cinétique d’agrégation en temps réel17,28. Cette méthode a l’avantage de permettre l’observation du comportement de la capside en solution mais requiert des concentrations élevées de capside purifiée, qui n’est peut-être pas tout à fait représentatives du virus dans son état naturel.
La dernière méthode utilisée par Moore et al. 17 a : microscopie électronique à transmission (TEM). Bien que cette méthode manque de sensibilité et ne produit pas de données quantitatives, il permet la visualisation des effets des différents traitements sur la structure de la capside virale. Bien que pas encore idéal pour les paramètres cliniques et environnementales, l’utilisation de ces méthodes en combinaison est utile dans la compréhension de l’inactivation des norovirus humain. Le but de cet article est de fournir des protocoles approfondies pour l’analyse de la liaison basée sur un plaque (ELASA), DLS, et les méthodes de préparation de TEM utilisées pour étudier les effets des traitements thermiques sur la capside des norovirus dans le contexte des effets des traitements sur la capside intégrité, tel que présenté dans Moore et al. 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole et les techniques décrites ici constituent un moyen d’évaluer les norovirus humains capside intégrité/fonctionnalités. Ces méthodes peuvent être utilisés pour l’obtention de mécaniste dans les effets de l’inactivation des traitements contre le virus et potentiellement peuvent compléter les méthodes d’évaluation inactivation plus traditionnels tels qu’essai RT-qPCR ou plaque. Par exemple, l’évaluation de l’inactivation chimique ou physique par des essais de plaque seul fournit une m…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par l’Agriculture and Food Research Initiative compétitive Grant no 2011-68003-30395 du United States Department of Agriculture, Institut National de l’alimentation et l’Agriculture à travers le projet NoroCORE. Frais d’accès ouvert a été financé par l’United States Department of Agriculture. Nous tenons à remercier Robert Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX) de bien vouloir nous les capsides purifiées et Valerie Lapham pour son aide avec les images TEM. Nous tenons également à remercier Frank N. Barry pour nous aider à commencer les expériences présentées.
Materials
| Plate-Based Binding Assay for Evaluating Loss of Higher Order Norovirus Capsid Structure | |||
| 96-well, medium-binding polystyrene EIA plate | Fisher (Costar) | 07-200-36 | |
| Lid for 96-well plate | Thermo Fisher | 3098 | |
| Paraffin film (Parafilm) | Thermo Fisher | PM999 | |
| 1x PBS (pH 7.2) | Life Technologies | 20012-050 | |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| 1x PBS (pH 7.2) + 0.05% Polysorbate 20 | N/A | N/A | |
| Purified, assembled human norovirus GII.4 capsids | N/A | N/A | |
| Individual 0.2 ml PCR tubes | Genesee Scientific | 22-154G | |
| 2 thermocyclers | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tabletop mini centrifuge | Fisher Scientific | 12-006-901 | |
| Skim milk solids | Thermo Fisher | LP0031B | |
| Synthetic histo-blood group type A disaccharide, biotinylated | Glycotech | 01-017 | |
| Biotinylated aptamer M6-2 (stock concentration 100 µM in nuclease-free water): 5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (ELISA grade), We use Life Technologies SNN2004 | Life Technologies | SNN2004 | |
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) substrate, room temperature | Thermo Fisher | 50-76-00 | |
| 1 M phosphoric acid | N/A | N/A | |
| Microplate reader capable of reading 450 nm | Tecan | Infinite m200 Pro | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis of Plate-Based Assay Results | |||
| Microsoft Excel or similar program | N/A | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynamic Light Scattering Experiments | |||
| Zetasizer ZSP, or similar particle size analysis instrument | Malvern Instruments | N/A | |
| Vortex | Fisher Scientifc | 02-215-365 | |
| Quartz cuvette | Hellma | 104-002-10-40 | |
| Small volume disposable cuvette (to reduce VLP use) | Malvern Instruments | ZEN0040 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transmission Electron Microscopy Sample Preparation | |||
| Nickel electron microscopy grids with carbon support film | Ladd Research | 10880-100 | |
| Self-closing reverse electron microscopy tweezers | Ted Pella | 5372-NM | |
| Qualitative filter paper | Sigma-Aldrich (Whatman) | WHA1002055 | |
| Glass petri dishes | Sigma-Aldrich | BR455743 | |
| 100 mM stock HEPES solution (pH 7.2) | N/A | N/A | |
| 2% uranyl acetate | N/A | N/A |
Referencias
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