代替体外ウイルスのカプシド構造健全性の定量方法
Summary
ウイルス遺伝子増幅を利用したルーチンの検出方法は、非感染性粒子から感染を区別する無力によって制限されます。この資料の目的は、アプタマー バインディング、動的光散乱、透過型電子顕微鏡を用いた感染症ノロウイルス粒子の識別を支援する別の方法について詳細なプロトコルを提供することです。
Abstract
ヒトのノロウイルスは、かなりの公衆衛生と世界的な経済損失を強要します。体外新興栽培の進歩はまだ適用されませんルーチン検出ウイルスのためです。電流検出と定量化技術は、核酸増幅に主に依存している差別しない非感染性のウイルス粒子の感染。この資料の目的は、さらにウイルス粒子の感染状況に関する情報を取得するために一緒に使用される技術の最近の進歩に関する特定の詳細を提示することです。1 つの技法は、カプシドにノロウイルス一本鎖 Dna アプタマーの結合を評価します。簡単に合成し、変更されているという利点がある、アプタマーとは、安価で安定しました。別の手法、動的光散乱 (DL)、ソリューションにおけるキャプシド挙動を観察することの利点があります。電子顕微鏡によるウイルスのカプシドの構造の整合性の可視化が可能です。有望なが非特異的アプタマーへのバインディングなど荷電分子サンプル マトリックスから dl、精製キャプシドの要件と感度不良電子顕微鏡検査のためのそれぞれの手法のいくつかの欠点があります。それにもかかわらず、これらの技術を組み合わせて使用する場合生成データの体について説明しますより包括的な感染性の正確な評価のために不可欠である情報を推論するためノロウイルス キャプシドの整合性不活化メソッドまたはウイルスの検出の解釈。この資料では、感染のヒトのノロウイルス粒子を識別するこれらのメソッドを使用してプロトコルを説明します。
Introduction
ヒトのノロウイルスはかなり保健負担を担当、世界的に約 6 億 8500 万病気や 212,000 人が死亡の原因と毎年1ドル2,3の十億の費用で。今日では、ノロウイルスの検出と定量化ゲノム増幅および/またはリガンド ベースのプラットフォームが含まれます。前者は、量的な情報はより敏感、偽陽性の結果4のリスクが低く、一般に好ましい。最も一般的なノロウイルスの検出と定量化ゲノム増幅技術は、逆転写酵素定量ポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR-RT) です。対象人間ノロウイルスのゲノムの小さなセグメントを増幅するので、RT qPCR だけでは感染を区別できないと非感染性粒子、無料のゲノム RNA として破損しているゲノムを含むカプシド、カプシドと致命的なゲノムの変異切り捨てはまだ Rt-qpcr によって増幅することができます。両方はまだウイルス定量 RT qPCR に依存し、まだ日常臨床・環境の可能なメソッドではありません 2 つ新しい体外栽培技術人間ノロウイルス5,6は、最近報告されているが、ヒトのノロウイルスをテストします。従って、RT qPCR 残る臨床・環境をテストするためのゴールド スタンダードです。
その他の培養方法は、ノロウイルス粒子の感染状態を適切に推定するために開発されています。これらのメソッドは、ノロウイルス キャプシドの整合性をアドレスとゲノムの評価として一般に分類できます。前者のアプローチはより普及しました。これは致命的な変異があるウイルス粒子と同様、ウイルスの粒子はそのまま残りますが、宿主受容体/co-因子をバインドする機能がないため考慮しませんしかし、一般的に使用されるメソッドはウイルスのゲノム RNA の抽出前に RNase 前処理または切り捨てたりゲノム7をわずかに破損しています。人間ノロウイルス co-receptor/共同因子、炭水化物であるにバインドする、ウイルスの能力に基づいて、キャプシドの整合性を評価できる病理組織血液型抗原 (HBGAs) として知られています。HBGAs 糖タンパク質や糖脂質 (他の複数の組織) の中の一部として宿主の腸管上皮細胞に存在し唾液のような体液の分泌があります。その表面上 HBGA 様物質を含む腸内細菌は、ヒトのノロウイルス8,9,10をバインドする示されているし、このような相互作用は、ノロウイルス感染症5を促進する可能性が。HBGA バインディングを活用の基本概念は、ウイルス粒子のみ、推定受容体/共同-factor をバインドできる細胞を感染させることができることです。複数の研究が核酸増幅の前ビーズ ベース HBGA バインディングが感染性差別11,12,13,14のための有望な方法であることを示唆しています。 15,16。HBGAs に関する主要な課題は、人間ノロウイルス遺伝子型のすべてをバインドできます単一 HBGA 型がないことです。これに対処するため HBGAs が含まれている、豚の胃粘液は、合成、一貫性、およびコスト削減の容易さの利益のための浄化された HBGA 炭水化物の代わりに使用されています。
ムーアらによって最近の出版17は、ヒトのノロウイルス キャプシド整合性を推定するための新しい技術のセットを導入しました。HBGAs、ムーアらの代わりに17広く反応性核酸アプタマー (M6-2)18 , 広く反応性モノクローナル抗体 (NS14)19熱処理 GII.4 シドニー ノロウイルス カプシド (ウイルス様粒子または群集) のバインドを調査し、これを比較して合成 HBGAs にバインドします。核酸アプタマーは、短い (20 ~ 80 nt) 単一鎖核酸 (一本鎖 Dna または RNA) それらの順序の結果としてユニークな立体構造に折るし、ターゲットをバインドします。核酸があり、彼らはより少なく高価です。簡単に化学的に合成、精製、および変更された;熱に安定しています。アプタマー ノロウイルスに対して生成のいくつかのレポートが存在するそれらのいくつかのさまざまな系統18,20,21,22に広範な反応性を示します。一例として、ムーアら17アプタマー M6 2 精製、組み立てられた人間ノロウイルス カプシド (群集) にバインドされのより高い順序 (例えば、二次、三次) タンパク質の構造を維持するためにウイルスのキャプシド依存 HBGA にも同様の振る舞いを示した発生するバインディング。その一方で、抗体にノロウイルス VLP バインディングのかなりの割合 NS14 は残った完全に変性させるとカプシド後です。ムーアらによる研究ではノロウイルスのバインディングの評価17が行われた elisa 法のような単純なプレート ベース メソッドを用いたアプタマーは抗体の代わりに使用する例外 (したがってメソッドが ELASA 呼び出された)。この高スループット実験法は、ノロウイルス カプシド、物理的または化学的ストレッサーへの露出にウイルス不活化の機構を理解する上で貴重な作品でさまざまな治療法の効果を評価する使用されました。ただし、このメソッドに欠点は、低感度とアプタマーによる非特異的結合を引き起こす可能性より高いレベルでの汚染物質のマトリックス関連の寛容の欠如です。
ムーアら17は、熱処理への応答でウイルス粒子の集合を監視するのに別の方法、動的光散乱法 (DLS) を使用しました。DLS は、ナノ粒子懸濁液のサイズを評価する使用され、蛋白質23,24やウイルス25,26,27に拡張されています。溶液中の粒子からの散乱光の強度は拡散係数と、確立された式を使用して粒径の計算を可能にする粒子の大きさの関数として変動します。DL 法は、サイズ27に基づいたウイルス集計や二量体、個々 のキャプシド分散されたウイルスの検出を可能にするナノスケールまで分散粒子の流体力学的直径を区別できます。粒子サイズの増加によって表される、ウイルスの集計はキャプシドの整合性の損失を表しています。カプシドの変性しその構造の破壊、疎水性残基さらされる、一緒にスティックし、集合体を形成する粒子を引き起こします。DLS は、指定した処理やリアルタイム17,28の集計速度後粒子サイズを測定する使用できます。このメソッド ソリューションのキャプシド挙動の観察を許可する利点がある完全自然の状態でウイルスを代表することができない精製キャプシドの高濃度が必要です。
ムーアらによって利用される最後の方法17は、透過型電子顕微鏡 (TEM) だった。このメソッドは、感度を欠いている、定量的データを生成しません、ウイルスのカプシド構造のさまざまな治療法の効果の可視化が可能です。まだ臨床/環境設定の理想的な組み合わせでこれらのメソッドの使用は人間のノロウイルス不活性化を理解する上で貴重です。プレート ベースの結合の試金 (ELASA)、DL の詳細なプロトコルを提供するこの記事の目的は、TEM の準備メソッドを使用してキャプシドに治療の及ぼす影響のコンテキストでノロウイルス キャプシドに及ぼす熱処理の効果を調査整合性・ ムーアらに提示されています。17。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコルとここで説明する手法は、人間ノロウイルス キャプシドの整合性/機能を評価する手段を提供します。これらのメソッドは、機械論的洞察、ウイルスに対する不活性化処理の効果を得るため使用することができ、Rt-qpcr またはプラーク アッセイなどのより伝統的な不活化評価方法を補うことができる可能性があります。たとえば、ウイルスの不活性化の程度のその不活性化の基に?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NoroCORE プロジェクトを通じて農業と食品研究イニシアチブ競争グラント号 2011-68003-30395 からアメリカ合衆国農務省、国立食品研究所、農業によって支えられました。オープン アクセス料金のための資金は、米国農務省によって提供されました。ロバート Atmar (薬の Baylor の大学、ヒューストン、TX) 提供いただきありがとうございます親切私たち精製カプシドとヴァレリー Lapham の TEM 画像で彼女の援助したいと思います。提示実験を開始私たちを助けるためフランク N. バリーに感謝も申し上げます。
Materials
| Plate-Based Binding Assay for Evaluating Loss of Higher Order Norovirus Capsid Structure | |||
| 96-well, medium-binding polystyrene EIA plate | Fisher (Costar) | 07-200-36 | |
| Lid for 96-well plate | Thermo Fisher | 3098 | |
| Paraffin film (Parafilm) | Thermo Fisher | PM999 | |
| 1x PBS (pH 7.2) | Life Technologies | 20012-050 | |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| 1x PBS (pH 7.2) + 0.05% Polysorbate 20 | N/A | N/A | |
| Purified, assembled human norovirus GII.4 capsids | N/A | N/A | |
| Individual 0.2 ml PCR tubes | Genesee Scientific | 22-154G | |
| 2 thermocyclers | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tabletop mini centrifuge | Fisher Scientific | 12-006-901 | |
| Skim milk solids | Thermo Fisher | LP0031B | |
| Synthetic histo-blood group type A disaccharide, biotinylated | Glycotech | 01-017 | |
| Biotinylated aptamer M6-2 (stock concentration 100 µM in nuclease-free water): 5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (ELISA grade), We use Life Technologies SNN2004 | Life Technologies | SNN2004 | |
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) substrate, room temperature | Thermo Fisher | 50-76-00 | |
| 1 M phosphoric acid | N/A | N/A | |
| Microplate reader capable of reading 450 nm | Tecan | Infinite m200 Pro | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis of Plate-Based Assay Results | |||
| Microsoft Excel or similar program | N/A | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynamic Light Scattering Experiments | |||
| Zetasizer ZSP, or similar particle size analysis instrument | Malvern Instruments | N/A | |
| Vortex | Fisher Scientifc | 02-215-365 | |
| Quartz cuvette | Hellma | 104-002-10-40 | |
| Small volume disposable cuvette (to reduce VLP use) | Malvern Instruments | ZEN0040 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transmission Electron Microscopy Sample Preparation | |||
| Nickel electron microscopy grids with carbon support film | Ladd Research | 10880-100 | |
| Self-closing reverse electron microscopy tweezers | Ted Pella | 5372-NM | |
| Qualitative filter paper | Sigma-Aldrich (Whatman) | WHA1002055 | |
| Glass petri dishes | Sigma-Aldrich | BR455743 | |
| 100 mM stock HEPES solution (pH 7.2) | N/A | N/A | |
| 2% uranyl acetate | N/A | N/A |
Referencias
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