Metodi alternativi In Vitro per la determinazione dell'integrità strutturale del capside virale
Summary
Metodi di rilevazione sistematica che utilizzano amplificazione del genoma virale sono limitati dalla loro incapacità di discriminare infettive da particelle non infettive. Lo scopo di questo articolo è di fornire protocolli dettagliati per metodi alternativi di aiuto nella discriminazione delle particelle infettive norovirus utilizzando l’associazione aptamer, diffusione dinamica della luce e microscopia elettronica di trasmissione.
Abstract
Norovirus umana esige di sanità pubblica considerevole e perdite economiche in tutto il mondo. Emergenti in vitro anticipi di coltivazione non sono ancora applicabili per la determinazione sistematica del virus. L’attuale rilevazione e quantificazione tecniche, che si basano principalmente su amplificazione degli acidi nucleici, non discriminare infettive da particelle virali non infettive. Lo scopo di questo articolo è di presentare dettagli specifici sui recenti progressi nelle tecniche utilizzate insieme al fine di acquisire ulteriori informazioni sullo stato di infettività delle particelle virali. Una tecnica prevede la valutazione di associazione di un aptamero ssDNA norovirus a capsidi. Aptameri hanno il vantaggio di essere facilmente sintetizzati e modificato e sono poco costosi e stabile. Un’altra tecnica, dynamic light scattering (DLS), ha il vantaggio di osservare il comportamento del capsid in soluzione. La microscopia elettronica consente la visualizzazione dell’integrità strutturale dei capsidi virali. Anche se promettente, ci sono alcuni svantaggi per ogni tecnica, ad esempio aspecifici aptamero associazione alle molecole caricati positivamente da matrici di campioni, requisito del capside purificato per liste di distribuzione e la scarsa sensibilità per microscopia elettronica. Tuttavia, quando queste tecniche vengono utilizzate in combinazione, il corpo di dati prodotti fornisce informazioni più complete sull’integrità del capsid di norovirus che possono essere utilizzate per dedurre infettività, informazioni che è essenziale per una valutazione accurata dei metodi di inattivazione o interpretazione di rilevazione dei virus. Questo articolo fornisce i protocolli per l’utilizzo di questi metodi per discriminare le particelle infettive umane norovirus.
Introduction
Norovirus umana è responsabile di un onere considerevole sanità pubblica a livello mondiale, causando malattie circa 685 milioni e 212.000 morti annualmente1, ad un costo di miliardi di dollari2,3. Oggi, quantificazione e norovirus rilevamento coinvolge amplificazione del genoma e/o piattaforme basate su ligando. Il primo è generalmente preferito quanto è più sensibile, fornisce informazioni quantitative e ha generalmente più a basso rischio di risultati falsi positivi4. La tecnica più comune norovirus rilevazione e quantificazione del genoma amplificazione è reazione a catena della polimerasi quantitativa della trascrittasi inversa (RT-qPCR). Perché esso è destinato e amplifica un piccolo segmento del genoma umano norovirus, RT-qPCR da solo non è in grado di discriminare tra infettive e particelle non infettive, come RNA genomico gratis, danneggiato capsidi contenenti genomi e capsidi con fatalmente genomi mutati/troncato possono ancora essere amplificati da RT-qPCR. Mentre due nuove in vitro tecniche colturali per norovirus umano5,6 sono state segnalate recentemente, entrambi ancora contare su RT-qPCR per quantificazione del virus e non sono ancora metodi fattibile per la routine clinica/ambientale test per i norovirus umani. Così, RT-qPCR rimane il gold standard per test clinici/ambientali.
Nel tentativo di valutare meglio lo stato di infettività delle particelle norovirus sono stati sviluppati altri metodi in vitro . Questi metodi possono essere classificati generalmente come quelli che riguardano l’integrità del capside norovirus e quelli valutando l’integrità genomica. Il primo approccio è più popolare. Un metodo comunemente usato è il pretrattamento di RNAsi prima dell’estrazione di RNA genomico virale, tuttavia questo non tiene conto per le particelle virali che rimangono intatte, ma mancano la capacità di legare i recettori/co-fattori dell’ospite, come pure le particelle virali che fatalmente hanno mutato o hanno troncato o danneggiato marginalmente genomi7. L’integrità del capsid possa anche essere valutato basato sulla capacità del virus di legarsi al norovirus umano co-receptor/co-fattori, che sono carboidrati conosciuto come antigeni di gruppo di histo-anima (HBGAs). HBGAs sono presenti in cellule epiteliali intestinali di host come parte di glicoproteine o glicolipidi (tra altri tessuti multipli) e può essere secreto nei fluidi corporei come la saliva. Batteri enterici contenenti sostanze simil-HBGA sulle loro superfici inoltre sono stati indicati per associare norovirus umano8,9,10, e tali interazioni possono promuovere norovirus infezione5. Il concetto di base dell’associazione HBGA di utilizzazione è che solo le particelle virali in grado di legare il putativo recettore/co-factor sarebbe in grado di infettare altre cellule. Gli studi multipli suggeriscono che l’associazione di HBGA basati su perlina precedente amplificazione degli acidi nucleici è un metodo promettente per infettività discriminazione11,12,13,14, 15,16. Una sfida importante per quanto riguarda HBGAs è che nessun singolo tipo HBGA possibile associare tutti i genotipi umani norovirus. Per risolvere questo problema, porcina mucina gastrica, che contiene HBGAs, è stata utilizzata al posto di carboidrati HBGA purificati nell’interesse di facilità di sintesi, coerenza e costi ridotti.
Una recente pubblicazione di Moore et al. 17 ha introdotto una serie di nuove tecniche per la stima dell’integrità umana norovirus capside. Al posto di HBGAs, Moore et al. 17 studiato il legame di un largamente reattivo dell’acido nucleico aptamero (M6-2)18 e largamente reattivo anticorpo monoclonale (NS14)19 al trattato termicamente capsidi di norovirus GII.4 Sydney (particelle virus-like o VLP) e rispetto a questo per l’associazione HBGAs sintetico. Acido nucleico aptameri sono breve (~ 20-80 nt) singolo incagliato acidi nucleici (RNA o ssDNA) che piegare in strutture tridimensionali uniche in conseguenza della loro sequenza e una destinazione. Perché sono gli acidi nucleici, sono meno costosi; facilmente chimicamente sintetizzati, purificati e modificati; e stabile al calore. Esistono parecchi rapporti di aptameri generati contro i norovirus, con alcuni di loro mostrando ampia reattività ad una varietà di ceppi18,20,21,22. A titolo di esempio, Moore et al. 17 hanno dimostrato quel aptamero M6-2 associato a capsidi norovirus umano purificato, assemblati (VLPs) e si sono comportati allo stesso modo di HBGA nell’affidamento sulle proteine del capside virale per mantenere la struttura della proteina di più alto ordine (ad es., secondaria e terziaria) per si verifichi l’associazione. D’altra parte, una percentuale significativa di legame norovirus VLP anticorpo NS14 rimase dopo capsidi erano completamente denaturati. Valutazione di norovirus associazione nello studio di Moore et al. 17 è stato fatto utilizzando un metodo semplice, basato su piastra, simile a ELISA, con l’eccezione che aptameri sono usati al posto di anticorpi (quindi il metodo è stato chiamato ELASA). Questo metodo sperimentale di throughput elevato è stato utilizzato per valutare gli effetti dei diversi trattamenti sul capside di norovirus, lavoro che è prezioso per la comprensione del meccanismo di inattivazione virale sull’esposizione a fattori di stress fisici o chimici. Tuttavia, uno svantaggio di questo metodo è la sensibilità e la mancanza di tolleranza per matrix-collegata di contaminanti a livelli più alti che causano il legame non specifico di aptameri inferiore.
Moore et al. 17 utilizzato un altro metodo, diffusione dinamica della luce (DLS), per monitorare l’aggregazione delle particelle virali in risposta ad un trattamento termico. DLS è comunemente usato per valutare la dimensione delle sospensioni di nanoparticella ed è stato esteso a proteine23,24 e virus25,26,27. L’intensità della luce diffusa dalle particelle in soluzione varia in funzione della dimensione delle particelle, consentendo per il calcolo del coefficiente di diffusione e quindi diametro della particella mediante formule ben consolidate. La tecnica di liste di distribuzione in grado di distinguere il diametro idrodinamico delle particelle disperse nanometriche, che permette la rilevazione di virus dispersi, proteine del capside individuali o dimeri e aggregati di virus basati su dimensioni27. Aggregazione di virus, rappresentato da un aumento della dimensione delle particelle, è indicativo di perdita di integrità del capside. Mentre le proteine del capside è denaturato e sua struttura interrotti, residui idrofobici diventano esposti e causano le particelle stare insieme e formare aggregati. Liste di distribuzione può essere utilizzato per misurare la dimensione delle particelle dopo un trattamento specificato o la cinetica di aggregazione in tempo reale17,28. Questo metodo ha il vantaggio di permettere l’osservazione del comportamento del capsid in soluzione ma richiede alte concentrazioni del capside purificata, che non può essere interamente rappresentativa del virus nel suo stato naturale.
L’ultimo metodo utilizzato da Moore et al. 17 era microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Sebbene questo metodo manca di sensibilità e non produce dati quantitativi, consente per la visualizzazione degli effetti di diversi trattamenti sulla struttura del capside virale. Anche se non è ancora ideale per impostazioni cliniche/ambientale, l’uso di questi metodi in combinazione è utile nella comprensione umana norovirus inattivazione. Lo scopo di questo articolo è quello di fornire approfondite protocolli per l’analisi di associazione basata su piastra (ELASA), DLS, e TEM preparazione metodi utilizzati per studiare gli effetti dei trattamenti termici sul capside di norovirus nel contesto degli effetti dei trattamenti sul capside integrità come presentato in Moore et al. 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo e le tecniche qui descritte forniscono un mezzo per valutare il norovirus umano del capsid integrità e funzionalità. Questi metodi possono essere utilizzati per ottenere informazioni mecanicistiche gli effetti dei trattamenti di inattivazione contro il virus e potenzialmente possono completare più tradizionali metodi di valutazione di inattivazione quale analisi di RT-qPCR o placca. Per esempio, la valutazione di inattivazione chimica o fisica di saggio della placca da solo fornisce una misura del grado …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dall’agricoltura e cibo ricerca iniziativa concorrenziale Grant n ° 2011-68003-30395 dal dipartimento dell’agricoltura degli Stati Uniti, Istituto nazionale di cibo e agricoltura attraverso il progetto NoroCORE. Finanziamenti a costo di accesso aperto è stato fornito dal dipartimento di agricoltura degli Stati Uniti. Vorremmo ringraziare Robert Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX) per gentilmente averci i capsidi purificate e Valerie Lapham per la sua assistenza con le immagini TEM. Vorremmo anche ringraziare Frank N. Barry per aiutarci a iniziare gli esperimenti presentati.
Materials
| Plate-Based Binding Assay for Evaluating Loss of Higher Order Norovirus Capsid Structure | |||
| 96-well, medium-binding polystyrene EIA plate | Fisher (Costar) | 07-200-36 | |
| Lid for 96-well plate | Thermo Fisher | 3098 | |
| Paraffin film (Parafilm) | Thermo Fisher | PM999 | |
| 1x PBS (pH 7.2) | Life Technologies | 20012-050 | |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| 1x PBS (pH 7.2) + 0.05% Polysorbate 20 | N/A | N/A | |
| Purified, assembled human norovirus GII.4 capsids | N/A | N/A | |
| Individual 0.2 ml PCR tubes | Genesee Scientific | 22-154G | |
| 2 thermocyclers | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tabletop mini centrifuge | Fisher Scientific | 12-006-901 | |
| Skim milk solids | Thermo Fisher | LP0031B | |
| Synthetic histo-blood group type A disaccharide, biotinylated | Glycotech | 01-017 | |
| Biotinylated aptamer M6-2 (stock concentration 100 µM in nuclease-free water): 5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (ELISA grade), We use Life Technologies SNN2004 | Life Technologies | SNN2004 | |
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) substrate, room temperature | Thermo Fisher | 50-76-00 | |
| 1 M phosphoric acid | N/A | N/A | |
| Microplate reader capable of reading 450 nm | Tecan | Infinite m200 Pro | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis of Plate-Based Assay Results | |||
| Microsoft Excel or similar program | N/A | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynamic Light Scattering Experiments | |||
| Zetasizer ZSP, or similar particle size analysis instrument | Malvern Instruments | N/A | |
| Vortex | Fisher Scientifc | 02-215-365 | |
| Quartz cuvette | Hellma | 104-002-10-40 | |
| Small volume disposable cuvette (to reduce VLP use) | Malvern Instruments | ZEN0040 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transmission Electron Microscopy Sample Preparation | |||
| Nickel electron microscopy grids with carbon support film | Ladd Research | 10880-100 | |
| Self-closing reverse electron microscopy tweezers | Ted Pella | 5372-NM | |
| Qualitative filter paper | Sigma-Aldrich (Whatman) | WHA1002055 | |
| Glass petri dishes | Sigma-Aldrich | BR455743 | |
| 100 mM stock HEPES solution (pH 7.2) | N/A | N/A | |
| 2% uranyl acetate | N/A | N/A |
Referencias
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