Lentivirale gemedieerde productie van transgene muizen: een eenvoudige en zeer efficiënte methode voor directe studie van oprichters
Summary
Hier presenteren we een protocol ter bevordering van de integratie van transgenic en productie van oprichter transgene muizen met hoge doeltreffendheid door een eenvoudige injectie van een lentivirale vector in de ruimte van de perivitelline van een bevruchte oöcyt.
Abstract
Bijna 40 jaar vertegenwoordigt pronuclear DNA injection de standaardmethode voor het genereren van transgene muizen met willekeurige integratie van transgenen. Dergelijke een routineprocedure wordt wijd gebruikt in de hele wereld en haar belangrijkste beperking woont in de arme werkzaamheid van transgenic integratie, wat resulteert in een laag rendement van oprichter dieren. Slechts enkele procenten van dieren die zijn geboren na implantatie van ingespoten bevruchte eicellen hebben geïntegreerd de transgenic. In tegenstelling, lentivirale vectoren zijn krachtige hulpmiddelen voor integratieve genenoverdracht en hun gebruik te transduce van de bevruchte eicellen kan zeer efficiënte productie van oprichter transgene muizen met een gemiddelde opbrengst boven de 70%. Bovendien, een stam van de muis kan worden gebruikt voor de productie van transgene dieren en de doordringendheid van transgenic meningsuiting is extreem hoog, boven de 80% met lentivirale gemedieerde Transgenese vergeleken met DNA microinjection. De grootte van het fragment van DNA die kan lading door de lentivirale vector is beperkt tot 10 kb en vertegenwoordigt de belangrijkste beperking van deze methode. Met behulp van een eenvoudige en gemakkelijk uit te voeren van injectie procedure onder de zona zitten van bevruchte eicellen, kunnen meer dan 50 oprichter dieren worden geproduceerd in een enkele sessie van microinjection. Deze methode is zeer aangepast uit te voeren, direct in de oprichter dieren, snelle winst en verlies van functie studies of scherm genomic DNA-regio’s voor hun vermogen om te controleren en reguleren gen expressie in vivo.
Introduction
Het baanbrekende werk van Gordon et al. in 1980 bleek dat de injectie van de plasmide-DNA in de mannelijke pronuclei van bevruchte eicellen na implantatie bij pseudopregnant muizen, de productie van transgene dieren die geïntegreerd kan opleveren de plasmide DNA1. De demonstratie dat transgene zoogdieren kunnen worden gegenereerd gehad een enorme impact op de wereldwijde biowetenschappen, openen de weg naar nieuwe velden van onderzoek zowel voor basiswetenschappen en translationeel Biomedische Wetenschappen. In de afgelopen vier decennia, is DNA microinjection een gangbare praktijk geworden. Hoewel een enorm aantal transgene muizen zijn vervaardigd, wordt de standaardmethode is niet volledig bruikbaar voor alle muis stammen en vereist tijdrovend backcrosses2,3. De toepassing ervan op andere soorten nog steeds uitdagend4 en de algehele transgenic integratie opbrengst is beperkt tot een paar percentage van geboren dieren5. Bovendien, betekent de werkzaamheid van transgenic integratie de beperkende factor die het slechte algehele rendement van pronuclear DNA injection verklaart. In dit opzicht, integratieve virale vectoren zijn de meest efficiënte gereedschappen om lading en integreren van transgenen en dus kon voorzien in nieuwe middelen aanzienlijk te verhogen integratie opbrengst, de enige beperking is dat de transgenic grootte die niet hoger zijn dan 10 kb6 .
Lentivirale vectoren pseudo-getypte met de envelop eiwitten van het Virus van vesiculaire Stomatitis (VSV) zijn pantropic en zeer integrative gene transfer tools en kunnen worden gebruikt om de bevruchte eicellen7transduce. De zona zitten rond de eicellen is een natuurlijke virus barrière en moet worden doorgegeven zodat transductie met de lentivirale vectoren. Transgene dieren zijn gegenereerd door transducing bevruchte eicellen na micro-boren of verwijderen van de zona zitten8,9. Echter, injectie onder de zona zitten in de perivitelline ruimte lijkt de eenvoudigste methode om de bevruchte eieren zoals oorspronkelijk beschreven door Lois en collega’s7transduce.
De perivitelline injectie van lentivirale vectoren kan hoge opbrengsten in de productie van transgene dieren die boven de 70% van de geboren dieren. Deze opbrengst is meer dan 10-fold hoger zijn dan het beste rendement dat kan worden bereikt met behulp van standaard pronuclei DNA injectie7,10,11. In deze context zal één sessie van injecties ten minste 50 transgene oprichters (F0) genereren. Het grote aantal oprichters compatible, dus met fenotypering van het effect van de transgenic rechtstreeks uitgevoerd op F0 Muizen zonder de noodzaak voor het genereren van transgene muis lijnen. Dit voordeel zorgt voor een snelle screening van het transgenic effect en is speciaal aangepast voor het uitvoeren van in vivo winst en verlies van functie studies binnen weken. Daarnaast kunnen regelgevende DNA-elementen ook worden snel gescreend om kaart smaakversterkers en DNA motieven gebonden transcriptie factoren11,12. Met pronuclear injecties integreren transgenen meestal als meerdere exemplaren in een unieke locus. Met lentivirale vectoren, integratie in meerdere loci treedt op als een enkel exemplaar per locus10,13. De veelheid van geïntegreerde loci daarom waarschijnlijk geassocieerd met de zeer hoge expressie doordringendheid waargenomen in de transgene stichters, waardoor de nieuw gegenereerde model robuuster.
Nog belangrijker is, bij het gebruik van pronuclear injectie van DNA, is visualisatie van pronuclei tijdens de procedure absoluut vereist. Deze technische beperking voorkomt het gebruik van de bevruchte eicellen die afkomstig zijn uit een grote verscheidenheid van stammen van de muis. Dus, de productie van een transgene model in een bepaalde stam voor welke pronuclei zijn onzichtbaar de productie van dieren in een tolerante stam gevolgd door ten minste 10 opeenvolgende backcrosses vereist overdracht van de transgenic in de gewenste muis stam. Met de lentivirale vector injecties, perivitelline ruimte is altijd zichtbaar en de injectie niet vereist zeer specifieke vaardigheden. Als voorbeeld, zijn knik/SCID transgene muizen die niet geschikt voor pronuclei injectie zijn verkregen met de virale vector injecties14.
Hier is een uitgebreide protocol gepresenteerd zodat eenvoudige productie van transgene muizen met behulp van lentivirale vector injecties in de ruimte van de perivitelline van een embryo van de fase één cel. Transgenic expressie gecontroleerd met een alomtegenwoordige of cel specifieke initiatiefnemers wordt in detail beschreven.
De ΔU3 van de lentivirale backbone van pTrip werd gebruikt in deze studie15. Deze vector kan voor het produceren van replicatie defecte lentivirale vectoren waarin de volgorde van de U3 is gedeeltelijk verwijderd om te verwijderen van de U3 promotor activiteit en het genereren van een zelf inactivating vector (SIN)16. Lentivirale vector voorraden werden geproduceerd door voorbijgaande transfectie van HEK-293T cellen met de p8.91 inkapseling plasmide (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, de codering van de vesiculaire stomatitis virus (VSV) glycoproteïne-G17, en de pTRIP-ΔU3 pHCMV-G recombinante vector. De gedetailleerde productie-procedure wordt hier geboden als aanvullende methoden.
Productie van hoge titer lentivirale vector voorraden wordt uitgevoerd onder Biosafety Level II voorwaarden (BSL-2). Dit geldt voor de meeste transgenen met uitzondering van oncogenen die moeten worden geproduceerd in BSL-3. Daarom is de productie in BSL-2 voorwaarden voor de meeste gevallen voldoende. Bovendien, zijn het gebruik en de productie meestal verbroken voor de meeste nationale regelgevende instanties die zich bezighouden met genetisch gemodificeerde organismen (GGO’s). Beperkte hoeveelheid replicatie incompetent SIN lentivirale vectoren (onder 2 µg p24 Eiwitmantel eiwit) kunnen worden gebruikt onder BSL-1 voorwaarden zoals beschreven door de Franse GGO-Agentschap in overeenstemming met de aanbevelingen van de Europese Unie.
Protocol
Representative Results
Discussion
De perivitelline injectie van lentivirale vectoren in bevruchte eicellen hier beschreven resulteerde in de productie van transgene embryo’s die meer dan 70% van transgene embryo’s ten opzichte van het totaal aantal verzamelde embryo’s opgeleverd. Dit resultaat is in overeenstemming met eerdere verslagen en is een voorbeeld van het specifieke karakter van de procedure2,7,10,11,<sup cl…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Magali Dumont en Rolando Meloni voor kritische lezing van het manuscript, de iVector en een Phenoparc ICM Cores voor technische bijstand in lentivirale vector productie en dierlijke respectievelijk huisvesting. Dit werk werd gesteund door het Institut Hospitalo-Universitaire de Neurosciences Translationnelles de Paris, IHU-A-ICM, Investissements d’Avenir ANR-10-IAIHU-06. P.R. ontvangen financiering voor de vereniging de Langue Française pour l’Etude du Diabète et des Maladies Métaboliques (ALFEDIAM) en een gezamenlijke JDRF / INSERM verlenen.
Materials
| PMSG 50UI | Sigma | G4527 | |
| hCG 5000UI | Sigma | CG5-1VL | |
| NaCl | Sigma | 7982 | |
| 100 mm petri dish | Dutsher | 353003 | |
| 4 wells Nunc dish | Dutsher | 56469 | IVF dish |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| 0,22 µm Syringe filter | Dutsher | 146611 | |
| Hyaluronidase Enzyme 30mg | Sigma | H4272 | mouse embryo tested |
| Insulin serynge | VWR | 613-3867 | Terumo Myjector |
| Curved forceps | Moria | 2183 | |
| Curved scissors | Moria | MC26 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard apparatus | GC 100-10 | |
| Horizontal micropipette puller | Narishige | PN-30 | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Inverted microscope | Nikon | Transferman NK2 5188 | Hoffman modulation contrast illumination is required |
| Micromanipulator | Eppendorf | Celltram air | |
| Controler of holding pipet | Eppendorf | Femtojet | |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | mouse embryo tested |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | Can be used to inject DNA or viral vectors |
| Dumont # 5 forceps | Moria | MC 40 | |
| vannas micro scissors | Moria | 9600 | |
| Isoflurane | centravet | ISO005 | ISO-VET 100% 250ml |
| ocrygel | centravet | OCR002 | |
| Povidone iodure | centravet | VET001 | vetedine 120ml |
| Buprenorphine | centravet | BUP002 | Buprecare 0,3Mg/ml 10ml |
| Tris-HCl | Sigma | T5941 | Trizma hydrochloride |
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| SDS | Sigma | 436143 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | powder |
| proteinase K | Sigma | P2308 | |
| oneTaq kit | NEB | M0480L | |
| Primers | Eurogentec | ||
| Strip of 8 PCR tube | 4titude | 4ti-0781 | |
| 96 well thermal cycler | Applied Biosystems | 4375786 | Veriti |
| Genomic DNA mini kit | invitrogen | K1820-02 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| qPCR Master mix | Roche | 4887352001 | SYBR Green |
| Multiwell plate 384 | Roche | 5217555001 | |
| qPCR instrument 384 well | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 |
Referencias
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes. Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).
- Miyakawa, Y., et al. Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice. British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).
- Hirabayashi, M., et al. A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes. Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).
- Isola, L. M., Gordon, J. W. Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine. Biotechnology. 16, 3-20 (1991).
- Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
- Ewerling, S., et al. Evaluation of laser-assisted lentiviral transgenesis in bovine. Transgenic Research. 15 (4), 447-454 (2006).
- Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors. Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).
- Park, F. Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis. Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).
- van Arensbergen, J., et al. A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element. PLoS One. 12 (2), e0171508 (2017).
- Friedli, M., et al. A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus. PLoS One. 5 (12), e15741 (2010).
- Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).
- Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background. Blood. 103 (2), 580-582 (2004).
- Zennou, V., et al. The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain. Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).
- Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. Development of a self-inactivating lentivirus vector. Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).
- Yee, J. K., et al. A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).
- Castaing, M., et al. Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells. Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).
- Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).
- Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants. Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).
- Norrman, K., et al. Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells. PLoS One. 5 (8), e12413 (2010).
- Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA. Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).
- Ohtsuka, M., et al. One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT). BMC Genomics. 16, 274 (2015).
- Tasic, B., et al. Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).
- Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection. Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).
- Garrels, W., et al. Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice. Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).
- Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
- Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, (2015).
- Philippe, S., et al. Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).
