Lentivirales mediación producción de ratones transgénicos: un método Simple y altamente eficiente para el estudio directo de los fundadores
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para promover la integración del transgén y la producción de ratones transgénicos fundador con alta eficacia por una simple inyección de lentivirales vector en el espacio perivitelino de un ovocito fertilizado.
Abstract
Durante casi 40 años, inyección pronuclear de ADN representa el método estándar para generar ratones transgénicos con la integración aleatoria de transgenes. Un procedimiento de rutina se utiliza extensamente en todo el mundo y su principal limitación reside en la pobre eficacia de la integración del transgén, resultando en un bajo rendimiento de los animales del fundador. Sólo pequeño porcentaje de animales nacidos después de la implantación de óvulos fertilizados inyectados ha integrado el transgén. Por el contrario, vectores lentivirales son poderosas herramientas para la transferencia de genes integradora y su uso para transducir ovocitos fertilizados permite producción altamente eficiente del fundador de ratones transgénicos con un rendimiento promedio superior al 70%. Además, cualquier cepa de ratón se puede utilizar para producir animales transgénicos y la penetrancia de la expresión del transgén es extremadamente alto, por encima del 80% con transgénesis mediada lentivirales comparado con microinyección de DNA. El tamaño del fragmento de ADN que puede ser carga por el vector lentivirales se limita a 10 kb y representa la principal limitación de este método. Usando un simple y fácil de realizar el procedimiento de inyección debajo de la zona pelúcida de ovocitos fertilizados, pueden producir más de 50 animales del fundador en una sola sesión de microinyección. Dicho método está altamente adaptado para llevar a cabo, directamente en los animales de fundador, rápida ganancia y pérdida de estudios de la función o a regiones de ADN genómicas de pantalla por su capacidad para controlar y regular la expresión génica en vivo.
Introduction
El trabajo pionero de Gordon et al. en 1980 demostró que después de la implantación en ratones seudopreñadas, la inyección de DNA de plásmido en la masculina pronúcleos de ovocitos fertilizados puede rendir la producción de animales transgénicos que integran el plásmido de ADN1. La demostración que mamíferos transgénicos pueden ser generados tuvo un enorme impacto en Ciencias de la vida mundiales, abriendo el camino a nuevos campos de investigación tanto en ciencias básicas y ciencias biomédicas traslacionales. En las últimas cuatro décadas, microinyección de ADN se ha convertido en una práctica habitual. Aunque se han producido un número enorme de ratones transgénicos, el método estándar no es plenamente utilizable para todas las cepas de ratón y requiere mucho tiempo retrocruzamientos2,3. Su aplicación a otras especies sigue siendo un reto4 y el rendimiento general de integración del transgén se limita a unos porcentaje de animales nacidos5. Además, la eficacia de la integración del transgen representa el factor limitante que explica el pobre rendimiento general de la inyección de ADN pronuclear. En este sentido, integrantes vectores virales son las más eficientes herramientas para carga e integran los transgenes y así podrían proporcionar nuevos medios para incrementar significativamente el rendimiento de la integración, la única limitación es que el tamaño del transgén que no puede superar los 10 kb6 .
Vectores lentivirales pseudo-mecanografiados con la proteína de la envoltura de los Virus de la Estomatitis Vesicular (VSV) son herramientas de transferencia de gen pantropic y altamente integrador y pueden utilizarse para transducir ovocitos fertilizados7. La zona pelúcida que rodea los ovocitos es una barrera natural virus y necesita ser pasado para permitir la transducción de los vectores lentivirales. Animales transgénicos han sido generados por transductoras ovocitos fertilizados después de micro perforación o extracción de la zona pelúcida8,9. Sin embargo, la inyección debajo de la zona pelúcida en el espacio perivitelino parece ser el método más simple para transducir los huevos fecundados como descrito inicialmente por Lois y colegas7.
La inyección de perivitelino de vectores lentivirales permite altos rendimientos en la producción de animales transgénicos que están sobre el 70% de los animales nacidos. Tal producción es más de 10 veces superior a la mejor producción que puede lograrse utilizando estándar pronúcleos ADN inyección7,10,11. En este contexto, una sola sesión de inyecciones generará a por lo menos 50 fundadores transgénicos (F0). Por lo tanto, el gran número de fundadores es compatible con fenotipo del transgen efecto directamente realizado sobre ratones F0 sin la necesidad de generar líneas de ratón transgénico. Esta ventaja permite la rápida detección de los efectos del transgen y está adaptada para realizar en vivo la ganancia y la pérdida de estudios de la función dentro de las semanas. Además, elementos reguladores del ADN pueden también rápidamente proyectará para asignar potenciadores y motivos de ADN por transcripción factores11,12. Con inyección pronuclear, los transgenes generalmente integrar copias múltiples en un único locus. Con vectores lentivirales, integración ocurre en loci múltiples como una sola copia por locus10,13. Por lo tanto, la multiplicidad de loci integrados es probablemente asociado a la penetrancia muy alta expresión observada en los transgénicos fundadores, que hace el nuevo modelo generando más robusto.
Lo importante, al utilizar inyección pronuclear de DNA, visualización de los pronúcleos durante el procedimiento es absolutamente necesario. Esta limitación técnica evita el uso de ovocitos fertilizados procedentes de una gran variedad de cepas de ratón. Por lo tanto, la producción de un modelo transgénico en un específico de la cepa para que pronúcleos son invisibles requiere la producción de animales en una cepa permisiva seguido por al menos 10 sucesivas retrocruzas para transferir el transgen en el ratón deseado cepa. Con las inyecciones de vectores lentivirales, espacio perivitelino siempre está visible y la inyección no requiere de habilidades muy específicas. Por ejemplo, se han obtenido ratones transgénicos NOD/SCID que no son apropiados para la inyección de pronúcleos con los vectores virales inyecciones14.
Aquí, se presenta un protocolo integral para permitir la simple producción de ratones transgénicos usando inyecciones lentivirales vector en el espacio perivitelino de un embrión de la etapa de una célula. Expresión del transgén controlada ya sea con ubicua o promotores específicos de la célula se describe en detalle.
El backbone lentivirales pTrip ΔU3 fue utilizado en este estudio15. Este vector permite la producción de vectores lentivirales defectuoso de replicación en la que la secuencia de U3 se ha eliminado parcialmente para eliminar la actividad de promotor de U3 y generar una uno mismo-inactivador de vector (pecado)16. Las poblaciones de vectores lentivirales fueron producidas por transitorios de la transfección de células HEK-293T con el p8.91 encapsulación plásmido (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, pHCMV-G codificación de la estomatitis vesicular (VSV) virus de la glicoproteína G17y el ΔU3 pTRIP vector recombinante. El procedimiento de producción detallada se proporciona como métodos suplementarios.
Producción de las poblaciones de vectores lentivirales de alto título se realiza en condiciones de nivel II de bioseguridad (BSL-2). Esto es cierto para la mayoría de los transgenes excepto oncogenes que tienen que ser producido en el BSL-3. Por lo tanto, la producción en condiciones BSL-2 para la mayoría de los casos es suficiente. Además, el uso y la producción generalmente se desconectan para la mayoría las agencias reguladoras nacionales con organismos modificados genéticamente (OMG). Cantidades limitadas de vectores lentivirales incompetentes de pecado la replicación (por debajo de 2 μg de la proteína de cápside p24) pueden utilizarse en condiciones BSL-1 según lo descrito por la agencia francesa OGM de acuerdo con las recomendaciones de la Unión Europea.
Protocol
Representative Results
Discussion
La inyección perivitelino de vectores lentivirales en ovocitos fertilizados descritos aquí dio lugar a la producción de embriones transgénicos que rindió más del 70% de los embriones transgénicos en relación con el número total de embriones colectados. Este resultado es consistente con informes anteriores y ejemplifica la especificidad del procedimiento2,7,10,11,<sup class="…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Magali Dumont y Rolando Meloni para lectura crítica del manuscrito y iVector y Phenoparc ICM corazones para asistencia técnica en la producción de vectores lentivirales y animal vivienda respectivamente. Este trabajo fue financiado por el Instituto Hospitalo-Universitaire de Neurociencias Translationnelles de París, IHU-A-ICM, Avenir Investissements ANR-10-IAIHU-06. P.R. recibidas fondos para la Asociación de Langue Française pour l ‘ Etude du diabetes et des Maladies Métaboliques (ALFEDIAM) y un conjunto JDRF / INSERM conceder.
Materials
| PMSG 50UI | Sigma | G4527 | |
| hCG 5000UI | Sigma | CG5-1VL | |
| NaCl | Sigma | 7982 | |
| 100 mm petri dish | Dutsher | 353003 | |
| 4 wells Nunc dish | Dutsher | 56469 | IVF dish |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| 0,22 µm Syringe filter | Dutsher | 146611 | |
| Hyaluronidase Enzyme 30mg | Sigma | H4272 | mouse embryo tested |
| Insulin serynge | VWR | 613-3867 | Terumo Myjector |
| Curved forceps | Moria | 2183 | |
| Curved scissors | Moria | MC26 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard apparatus | GC 100-10 | |
| Horizontal micropipette puller | Narishige | PN-30 | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Inverted microscope | Nikon | Transferman NK2 5188 | Hoffman modulation contrast illumination is required |
| Micromanipulator | Eppendorf | Celltram air | |
| Controler of holding pipet | Eppendorf | Femtojet | |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | mouse embryo tested |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | Can be used to inject DNA or viral vectors |
| Dumont # 5 forceps | Moria | MC 40 | |
| vannas micro scissors | Moria | 9600 | |
| Isoflurane | centravet | ISO005 | ISO-VET 100% 250ml |
| ocrygel | centravet | OCR002 | |
| Povidone iodure | centravet | VET001 | vetedine 120ml |
| Buprenorphine | centravet | BUP002 | Buprecare 0,3Mg/ml 10ml |
| Tris-HCl | Sigma | T5941 | Trizma hydrochloride |
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| SDS | Sigma | 436143 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | powder |
| proteinase K | Sigma | P2308 | |
| oneTaq kit | NEB | M0480L | |
| Primers | Eurogentec | ||
| Strip of 8 PCR tube | 4titude | 4ti-0781 | |
| 96 well thermal cycler | Applied Biosystems | 4375786 | Veriti |
| Genomic DNA mini kit | invitrogen | K1820-02 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| qPCR Master mix | Roche | 4887352001 | SYBR Green |
| Multiwell plate 384 | Roche | 5217555001 | |
| qPCR instrument 384 well | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 |
Referencias
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes. Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).
- Miyakawa, Y., et al. Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice. British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).
- Hirabayashi, M., et al. A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes. Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).
- Isola, L. M., Gordon, J. W. Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine. Biotechnology. 16, 3-20 (1991).
- Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
- Ewerling, S., et al. Evaluation of laser-assisted lentiviral transgenesis in bovine. Transgenic Research. 15 (4), 447-454 (2006).
- Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors. Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).
- Park, F. Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis. Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).
- van Arensbergen, J., et al. A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element. PLoS One. 12 (2), e0171508 (2017).
- Friedli, M., et al. A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus. PLoS One. 5 (12), e15741 (2010).
- Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).
- Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background. Blood. 103 (2), 580-582 (2004).
- Zennou, V., et al. The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain. Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).
- Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. Development of a self-inactivating lentivirus vector. Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).
- Yee, J. K., et al. A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).
- Castaing, M., et al. Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells. Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).
- Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).
- Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants. Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).
- Norrman, K., et al. Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells. PLoS One. 5 (8), e12413 (2010).
- Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA. Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).
- Ohtsuka, M., et al. One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT). BMC Genomics. 16, 274 (2015).
- Tasic, B., et al. Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).
- Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection. Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).
- Garrels, W., et al. Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice. Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).
- Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
- Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, (2015).
- Philippe, S., et al. Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).
