Лентивирусные опосредованной производства трансгенных мышей: простой и очень эффективный метод для непосредственного изучения учредителей
Summary
Здесь мы представляем протокол для содействия интеграции трансген и основатель трансгенных мышей с высокой эффективности производства путем простой инъекции лентивирусные вектора в пространстве наблюдаться оплодотворенной яйцеклетки.
Abstract
Почти 40 лет pronuclear ДНК инъекций представляет собой стандартный метод для создания трансгенных мышей с случайных интеграции трансгенов. Такая обычная процедура широко используется во всем мире и его основное ограничение проживает в бедных эффективность интеграции трансген, что приводит к низкой урожайности основатель животных. Трансген включили только несколько процентов животных, родившихся после имплантации вводят оплодотворенных яйцеклеток. Напротив лентивирусные векторы являются мощными инструментами для переноса интегративной генов и их использование для передают оплодотворенной яйцеклетки позволяет высокоэффективное производство основателя трансгенных мышей с средняя урожайность выше 70%. Кроме того любой штамм мыши могут использоваться для производства трансгенных животных и пенетрантностью трансген выражение является чрезвычайно высокой, выше 80% с лентивирусные опосредованной трансгенез, по сравнению с ДНК микроинъекции. Размер фрагмента ДНК, которая может быть груз лентивирусные вектор ограничено 10 КБ и представляет собой главное ограничение этого метода. С помощью простой и легко выполнять процедуры инъекции под вителлинового оплодотворенных яйцеклеток, более чем 50 основатель животных могут быть произведены в одной сессии микроинъекции. Такой метод является очень приспособлены для выполнения непосредственно в основатель животных, быстрый выигрыш и потери функции исследований или геномной ДНК областей экрана для их способность контролировать и регулировать ген выражение в естественных условиях.
Introduction
Новаторскую работу Гордон et al. в 1980 году показал, что после имплантации в pseudopregnant мышей, плазмида ДНК инъекции в мужской pronuclei оплодотворенных яйцеклеток может принести производства трансгенных животных, которые интегрированы плазмида ДНК1. Демонстрация, что могут быть получены трансгенные млекопитающих оказали огромное воздействие на глобальные наук о жизни, открыв путь к Роман областях исследований, как для фундаментальных наук и трансляционная биомедицинских наук. В последние четыре десятилетия ДНК микроинъекции стало обычной практикой. Хотя огромное количество трансгенных мышей были произведены, стандартный метод не является полностью пригоден для всех штаммов мыши и требует много времени беккроссов2,3. Его применение в отношении других видов остается сложной4 и урожайность трансген интеграции ограничивается несколько процент род животных5. Кроме того эффективность интеграции трансген представляет сдерживающим фактором, который объясняет бедных урожайность pronuclear ДНК инъекции. В этой связи интегративной вирусных векторов являются наиболее эффективные инструменты для груза и интегрировать трансгенов и таким образом может предоставить новые средства для значительного увеличения урожайности интеграции, единственное ограничение в том, что размер трансген, который не может превышать 10 КБ6 .
Лентивирусные векторы псевдо-типизированных с конверт белков вируса везикулярного стоматита (ВСВ) являются инструментами передачи pantropic и высоко интегративной гена и может использоваться для передают оплодотворенных яйцеклеток7. Zona pellucida окружающих яйцеклеток является естественным вирус барьер и должен быть передан позволить трансдукция с лентивирусные векторы. Трансгенные животные были получены путем преобразования оплодотворенных яйцеклеток после микро бурение или удаление вителлинового8,9. Однако инъекции под вителлинового в пространстве наблюдаться, по-видимому, самый простой способ передавать оплодотворенные яйца как первоначально описано Лоис и коллеги-7.
Наблюдаться инъекции лентивирусные векторы позволяет высокие урожаи в производстве трансгенных животных, которые находятся выше 70% род животных. Такая доходность свыше 10 раз выше, чем лучший доходность, которая может быть достигнута с помощью стандартных pronuclei ДНК инъекций7,10,11. В этом контексте одной сессии инъекции создаст по меньшей мере 50 основатели трансгенное (F0). Таким образом, большое количество учредителей совместим с фенотипирование эффекта трансген, непосредственно над F0 мышей без необходимости создания трансгенные мыши линии. Это преимущество позволяет для быстрого скрининга трансген эффект и специально приспособлены для выполнения в vivo выгоды и потери функции исследований в течение недели. Кроме того регулирующие элементы ДНК можно также быстро проверяться на карте усилители и ДНК мотивы связаны факторы транскрипции11,12. С pronuclear инъекции трансгенов обычно интегрировать как несколько копий в уникальный Локус. С лентивирусные векторы интеграция происходит в нескольких локусов одну копию за Локус10,13. Таким образом множество интегрированных локусов скорее связаны с очень высокой выражение пенетрантностью, наблюдается в трансгенных учредителей, что делает новый сгенерированной модели более надежной.
Важно отметить, что при использовании pronuclear для инъекций ДНК, визуализация pronuclei во время процедуры абсолютно необходим. Это техническое ограничение предотвращает использование оплодотворенных яйцеклеток, происходящих из разнообразных штаммов мыши. Таким образом, производство трансгенных модели в определенном напрягаться, для которых pronuclei невидимый требует производства животных в разрешительной штамм следуют по крайней мере 10 последовательных беккроссов для передачи трансген в желаемой мыши штамм. С лентивирусные вектор инъекции наблюдаться пространства всегда видна и инъекции не требует узкоспециализированных навыков. В качестве примера NOD/SCID трансгенных мышей, которые не подходят для инъекций pronuclei были получены с вирусный вектор инъекции14.
Здесь всеобъемлющий протокол представляется простой производства трансгенных мышей с использованием инъекций лентивирусные вектора в пространстве наблюдаться одной ячейки стадии эмбриона. Трансген выражение, контролируемых либо с вездесущими или подробно описаны конкретные промоутеров ячейки.
PTrip ΔU3 лентивирусные костяк был использован в данном исследовании15. Этот вектор позволяет производить репликацию дефектных лентивирусные векторы, в которых последовательность U3 был частично удален чтобы удалить U3 промоутер активности и создания самостоятельной инактивирующего вектор (SIN)16. Лентивирусные вектор запасы были произведены переходных transfection клеток ГЭС 293T с p8.91 инкапсуляции плазмида (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, pHCMV-G кодирование гликопротеин G (ВСВ) вирус везикулярного стоматита17и pTRIP ΔU3 Рекомбинатные вектор. Процедура подробно производства предоставляется в качестве дополнительных методов.
Производство высокого титра лентивирусные вектор запасов осуществляется в условиях биобезопасности уровня II (BSL-2). Это верно для большинства трансгенов за исключением онкогенов, которые должны быть произведены в BSL-3. Таким образом производство в условиях BSL-2 в большинстве случаев достаточно. Кроме того использование и производство обычно отключены для большинства национальных регулирующих органов, занимающихся генетически модифицированных организмов (ГМО). Ограниченное количество некомпетентных ГРЕХ репликации лентивирусные векторы (ниже 2 мкг белка капсид p24) может использоваться в условиях BSL-1, как описано в ГИО французского Агентства согласился с рекомендациями Европейского союза.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наблюдаться инъекции лентивирусные векторы в оплодотворенных яйцеклеток, описанные здесь в результате производства трансгенных эмбрионов, которые принесли более чем 70% эмбрионов трансгенных относительно общее количество собранных эмбрионов. Этот результат согласуется с предыдущим…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Магали Дюмон и Роландо Мелони для критических чтении рукописи и iVector и Phenoparc ядер ICM для оказания технической помощи в производстве лентивирусные вектор и животных жилья соответственно. Эта работа была поддержана нейронаук де Hospitalo-Университетский институт Translationnelles de Paris, IHU-A-ICM, будущее Investissements АНР-10-IAIHU-06. P.R. получил финансирование ассоциации де Langue Française pour l’Etude du Diabète et des Maladies Métaboliques (ALFEDIAM) и совместных JDRF / INSERM гранта.
Materials
| PMSG 50UI | Sigma | G4527 | |
| hCG 5000UI | Sigma | CG5-1VL | |
| NaCl | Sigma | 7982 | |
| 100 mm petri dish | Dutsher | 353003 | |
| 4 wells Nunc dish | Dutsher | 56469 | IVF dish |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| 0,22 µm Syringe filter | Dutsher | 146611 | |
| Hyaluronidase Enzyme 30mg | Sigma | H4272 | mouse embryo tested |
| Insulin serynge | VWR | 613-3867 | Terumo Myjector |
| Curved forceps | Moria | 2183 | |
| Curved scissors | Moria | MC26 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard apparatus | GC 100-10 | |
| Horizontal micropipette puller | Narishige | PN-30 | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Inverted microscope | Nikon | Transferman NK2 5188 | Hoffman modulation contrast illumination is required |
| Micromanipulator | Eppendorf | Celltram air | |
| Controler of holding pipet | Eppendorf | Femtojet | |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | mouse embryo tested |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | Can be used to inject DNA or viral vectors |
| Dumont # 5 forceps | Moria | MC 40 | |
| vannas micro scissors | Moria | 9600 | |
| Isoflurane | centravet | ISO005 | ISO-VET 100% 250ml |
| ocrygel | centravet | OCR002 | |
| Povidone iodure | centravet | VET001 | vetedine 120ml |
| Buprenorphine | centravet | BUP002 | Buprecare 0,3Mg/ml 10ml |
| Tris-HCl | Sigma | T5941 | Trizma hydrochloride |
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| SDS | Sigma | 436143 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | powder |
| proteinase K | Sigma | P2308 | |
| oneTaq kit | NEB | M0480L | |
| Primers | Eurogentec | ||
| Strip of 8 PCR tube | 4titude | 4ti-0781 | |
| 96 well thermal cycler | Applied Biosystems | 4375786 | Veriti |
| Genomic DNA mini kit | invitrogen | K1820-02 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| qPCR Master mix | Roche | 4887352001 | SYBR Green |
| Multiwell plate 384 | Roche | 5217555001 | |
| qPCR instrument 384 well | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 |
Referencias
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes. Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).
- Miyakawa, Y., et al. Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice. British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).
- Hirabayashi, M., et al. A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes. Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).
- Isola, L. M., Gordon, J. W. Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine. Biotechnology. 16, 3-20 (1991).
- Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
- Ewerling, S., et al. Evaluation of laser-assisted lentiviral transgenesis in bovine. Transgenic Research. 15 (4), 447-454 (2006).
- Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors. Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).
- Park, F. Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis. Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).
- van Arensbergen, J., et al. A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element. PLoS One. 12 (2), e0171508 (2017).
- Friedli, M., et al. A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus. PLoS One. 5 (12), e15741 (2010).
- Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).
- Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background. Blood. 103 (2), 580-582 (2004).
- Zennou, V., et al. The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain. Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).
- Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. Development of a self-inactivating lentivirus vector. Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).
- Yee, J. K., et al. A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).
- Castaing, M., et al. Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells. Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).
- Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).
- Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants. Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).
- Norrman, K., et al. Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells. PLoS One. 5 (8), e12413 (2010).
- Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA. Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).
- Ohtsuka, M., et al. One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT). BMC Genomics. 16, 274 (2015).
- Tasic, B., et al. Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).
- Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection. Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).
- Garrels, W., et al. Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice. Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).
- Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
- Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, (2015).
- Philippe, S., et al. Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).
