ميكانيكا خلية السبر مع ملاقط خالية من حبة الضوئية في الجنين المورفولوجية
Summary
نقدم داد ملاقط بصرية بالإضافة إلى مجهر ورقة خفيفة، وتنفيذه للتحقيق ميكانيكا الخلية دون الخرز في الجنين المورفولوجية .
Abstract
Morphogenesis يتطلب التنسيق بين القوات الميكانيكية لتشكيل قوة الخلايا والأنسجة والزخرفة الوراثية. ومن ثم تحديا لفهم العمليات morphogenetic مباشرة قياس قوات الخلوية والخصائص الميكانيكية في فيفو أثناء امبريوجينيسيس. نقدم هنا، داد ملاقط بصرية بالإضافة إلى مجهر ورقة ضوء، مما يسمح لمباشرة تطبيق القوات على الاتصالات خلية الجنين المورفولوجية المبكر، بينما التصوير بسرعة عدة إطارات في الثانية الواحدة. ويمتاز هذا الأسلوب فإنه يحتاج إلى حقن الخرز إلى الجنين، عادة ما تستخدم كالوسيطة المسابير التي تبذل قوات الضوئية. ونحن بالتفصيل خطوة بخطوة في تنفيذ برنامج الإعداد، واقتراح أدوات لاستخراج المعلومات الميكانيكية من التجارب. برصد عمليات النزوح من خلية خلية الاتصالات في الوقت الحقيقي، يمكن للمرء إجراء قياسات التوتر والتحقيق ريولوجيا خلية الاتصالات.
Introduction
التطور الجنيني هو عملية استنساخه بشدة خلالها الخلايا والأنسجة التي تشوه شكل الحيوان مستقبلا. أظهرت هذه التشوهات تتطلب توليد النشطة من القوات في مستوى1،الخلية2. فهم العمليات morphogenetic خلالها الخلايا والأنسجة تغيير شكلها، هو ذلك المفتاح لتقييم الخواص الميكانيكية للخلايا المعنية، وقياس القوى داخل الأنسجة خلال3،العملية4 . وقد درست طبقات طلائي، لا سيما في المورفولوجية، على نطاق واسع سبب هذه الهندسة شبه 2D والتلاعب سهولة.
وهكذا وضعت عددا من التقنيات وغيرهم لتقييم ميكانيكا الظهارية في فيفو أثناء التطوير. وسوف نعطي لمحة سريعة عن التقنيات الرئيسية الثلاثة المستخدمة في الأنسجة الظهارية. ليزر تذرية، أسلوب مستخدمة على نطاق واسع، يسمح للكشف عن الضغط الميكانيكي المحلية في الخلية تقاطعات5،6،،من78 أو في أكبر حجم9،10،11 عن طريق إجراء تخفيضات المحلية التي تخل بسلامة الميكانيكية للهدف. القوى المحركة لفتح عقب القطع يوفر معلومات على الاجتثاث مسبقة الإجهاد، وعلى ريولوجيا ل النسيج12،13. عيب تذرية الليزر أنها الغازية، كما أنه يتطلب تعطيل القشرة الخلية المحلية. ومن ثم، واحدة فقط تنفيذ عدد محدود من أبلاتيونس إذا كان أحد يرغب في المحافظة على سلامة الأنسجة. عيب آخر هو أن أبلاتيونس لا تقدم سوى التقديرات النسبية للتوتر في خلية الاتصالات، نظراً لسرعة فتح تعتمد على الاحتكاك اللزج، الذي هو عموما غير معروف. وقد تم التلاعب المغناطيسي أيضا وضعها واستخدامها في المورفولوجية، التي تنطوي على استخدام فيروفلويدس14 أو15من أولتراماجنيتيك الدهنية. أنها يمكن أن توفر قياسات مطلقة16،17، ولكن هي أيضا الغازية بمعنى أنها تحتاج إلى حقن تحقيقات في الموقع المطلوب. وهذا يمكن أن تكون صعبة للغاية اعتماداً على النظام، هي ليست دائماً قابلة للحقن دقيقة. تقنية ثالث، غير الغازية على تماما، هو قوة الاستدلال18،،من1920. قوة الاستدلال يعتمد على افتراض التوازن الميكانيكي في نقاط ثلاثية (الوصلات تريسيلولار أو القمم)، ويسمح باستنتاج التوتر في كل خلية-خلية الاتصالات (وربما الضغوط في كافة الخلايا) بحل مشكلة معكوس. للتوترات، ويوفر كل ذروة معادلتين (X و Y). وهذا ينتج نظام كبير من المعادلات الخطية التي يمكن مقلوب تحت بعض الظروف لتقييم التوتر في كل خلية الاتصالات. في حين أن هذا الأسلوب جذابة للغاية، إلا أنها تتطلب صورة مجزأة ولا من تجربة إضافية أو الإعداد، لم يتحدد دقة لتحديد، ومرة أخرى فإنه يوفر فقط القيم النسبية، ما لم يتم تنفيذ قياس معايرة مطلقة.
للتغلب على بعض هذه القيود، نقدم في هذه المقالة داد ملاقط بصرية بالإضافة إلى مجهر ورقة خفيفة لتطبيق القوات الخاضعة للمراقبة على مستوى الخلية في ظهارة الجنينية من melanogaster المورفولوجية. وقد استخدمت ملاقط بصرية للعديد من التطبيقات البيولوجية بما في ذلك القياسات على البروتينات وحيدة والتلاعب من العضيات والخلايا21. هنا، نحن تقرير قوات التطبيقية في نطاق pN عشرات قليلة، وصغيرة كافية بعد للحث على التشوهات المحلية للاتصالات المحمولة وإجراء القياسات الميكانيكية في الجسم الحي. عادة ما نستخدم انحراف عمودي لاتصالات الخليوي، ترصد من خلال تحليل كيموجرافس، تتعلق بالقوة إلى تشوه. الأهم من ذلك، لدينا الإعداد لا تتطلب حقن الخرز في الموقع المطلوب في الأنسجة، وملاقط بصرية قادرون على بذل القوات في خلية خلية اتصالات مباشرة. اقتران ملاقط بصرية مجهر ورقة ضوء يسمح أحد للقيام بالتصوير السريع (عدة إطارات في الثانية الواحدة)، وملحوظ جداً لإجراء تحليل ميكانيكية في فترات زمنية قصيرة، ومع انخفاض الضيائية، منذ الإضاءة نموذج يقتصر على الطائرة من التصوير22.
ملاقط الضوئية عموما، وطريقة غير الغازية لتطبيق القوات الخاضعة للرقابة في خلية الاتصالات في المجراة في الجنين المورفولوجية ، واستخراج المعلومات الميكانيكية مثل تصلب والتوتر في خلية الاتصالات23، خصائص انسيابية 24، ومن التدرج أو تباين من التوتر23.
Protocol
Representative Results
Discussion
ملاقط بصرية تسمح لإجراء القياسات الميكانيكية المطلقة في ظهارة الجنينية النامية مباشرة بطريقة غير الغازية. وبهذا المعني، فإنه يقدم مزايا أكثر أساليب أخرى مثل التذرية الليزر، التي هي الغازية وتوفير القياسات النسبية، والقوى المغناطيسية، التي تتطلب الحقن، أو قوة الاستدلال، الذي يعتمد على …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل العلاجات ايكيب منحة العلاجات DEQ20130326509، الوكالة الوطنية de la بحوث بلانك ANR “منحة”، ANR مورفور-11-BSV5-0008 (إلى ص-ف). نحن نعترف بفرنسا-بيويماجينج البنية التحتية تدعمها وكالة الأبحاث الوطنية الفرنسية (ANR-10-إينبس-04-01، «الاستثمارات في المستقبل»). ونحن نشكر ديتايليور برايس وموريتي كلود من البنية التحتية بيكسل–مكتب التحقيقات الفدرالي للمساعدة التقنية.
Materials
| Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW | IPG Laser | YLM-10-LP-SC | including collimator LP : beam D=1.6 mm and red guide laser |
| Ø1/2" Optical Beam Shutter | Thorlabs | SH05 | |
| Small Beam Diameter Galvanometer Systems | Thorlabs | GVS001 | 1 for X displacement, 1 for Y displacement |
| 1D or 2D Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | galvanometers power supply |
| 2 lenses f = 30mm | Thorlabs | LB1757-B | relay telescope between 2 galva |
| Lens f = 200mm | Thorlabs | LB1945-B | 2.5X telescope |
| Lens f = 500mm | Thorlabs | LB1869-B | 2.5X telescope |
| Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes | Thorlabs | KCB1E | Periscope |
| Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style | Thorlabs | LG1 | |
| 45° AOI, 50.0mm Diameter, Hot Mirror | Edmund Optics | #64-470 | |
| Multiphoton-Emitter HC 750/S | AHF | HC 750/SP | |
| CompactDAQ Chassis | National Instruments | cDAQ-9178 | |
| C Series Voltage Output Module | National Instruments | NI-9263 | Analog output module |
| C Series Voltage Input Module | National Instruments | NI-9215 | Analog input module |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 µm, red fluorescent (580/605), 2% solids | ThermoFisher Scientific | F8812 | calibration beads |
| C++ (Qt) home made optical tweezers software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès. Alternative solution: labview |
Referencias
- Lecuit, T., Lenne, P. -. F., Munro, E. Force generation, transmission, and integration during cell and tissue morphogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 27 (1), 157-184 (2011).
- Heisenberg, C. -. P., Bellaïche, Y. Forces in tissue morphogenesis and patterning. Cell. 153 (5), 948-962 (2013).
- Sugimura, K., Lenne, P. -. F., Graner, F. Measuring forces and stresses in situ in living tissues. Development. 143 (2), 186-196 (2016).
- Campàs, O. A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues. Seminars in cell & developmental biology. 55, 119-130 (2016).
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. Journal of Cell Biology. 149 (2), 471-490 (2000).
- Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing. Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).
- Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nature Cell biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).
- Ma, X., Lynch, H. E., Scully, P. C., Hutson, M. S. Probing embryonic tissue mechanics with laser hole drilling. Physical Biology. 6 (3), 036004 (2009).
- Hutson, M. S., Tokutake, Y., et al. Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling. Science. 300 (5616), 145-149 (2003).
- Bonnet, I., Marcq, P., Bosveld, F., Fetler, L., Bellaïche, Y., Graner, F. Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9 (75), 2614-2623 (2012).
- Etournay, R., Popović, M., et al. Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing. eLife. 4, e07090 (2015).
- Rauzi, M., Lenne, P. -. F. Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis. Current topics in developmental biology. 95, 93-144 (2011).
- Saha, A., Nishikawa, M., Behrndt, M., Heisenberg, C. -. P., Jülicher, F., Grill, S. W. Determining Physical Properties of the Cell Cortex. Biophysical journal. 110 (6), 1421-1429 (2016).
- Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. A., Beaurepaire, E., Farge, E. Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos. Developmental cell. 15 (3), 470-477 (2008).
- Mitrossilis, D., Röper, J. -. C., et al. Mechanotransductive cascade of Myo-II-dependent mesoderm and endoderm invaginations in embryo gastrulation. Nature Communications. 8, 13883 (2017).
- Campàs, O., Mammoto, T., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2013).
- Serwane, F., Mongera, A., et al. In vivo quantification of spatially varying mechanical properties in developing tissues. Nature Methods. 14 (2), 181-186 (2017).
- Chiou, K. K., Hufnagel, L., Shraiman, B. I. Mechanical stress inference for two dimensional cell arrays. PLoS computational biology. 8 (5), e1002512 (2012).
- Ishihara, S., Sugimura, K. Bayesian inference of force dynamics during morphogenesis. Journal of theoretical biology. 313, 201-211 (2012).
- Brodland, G. W., Veldhuis, J. H., Kim, S., Perrone, M., Mashburn, D., Hutson, M. S. CellFIT: a cellular force-inference toolkit using curvilinear cell boundaries. PLoS ONE. 9 (6), e99116 (2014).
- Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 247-285 (1994).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Bambardekar, K., Clément, R., Blanc, O., Chardès, C., Lenne, P. -. F. Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).
- Clément, R., Dehapiot, B., Collinet, C., Lecuit, T., Lenne, P. -. F. Viscoelastic Dissipation Stabilizes Cell Shape Changes during Tissue Morphogenesis. Current biology: CB. 27 (20), (2017).
- Chardès, C., Ménélec, P., Bertrand, V., Lenne, P. -. F. Setting-up a simple light sheet microscope for in toto imaging of C. elegans development. Journal of visualized experiments. 87, e51342 (2014).
- Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).
- Cavey, M., Lecuit, T. Imaging Cellular and Molecular Dynamics in Live Embryos Using Fluorescent Proteins. Drosophila. 420, 219-238 (2008).
