Indringende cel mechanica met kraal-vrije optisch pincet in de Drosophila Embryo
Summary
Presenteren we een installatie van optisch pincet gekoppeld aan een lichte blad Microscoop, en de uitvoering daarvan om te sonderen cel mechanica zonder kralen in de Drosophila embryo.
Abstract
Morfogenese vereist coördinatie tussen genetische patronen en mechanische krachten krachtig vorm van de cellen en weefsels. Vandaar, is een uitdaging voor een beter begrip morfogenetische direct cellulaire krachten en de te meten mechanische eigenschappen in vivo tijdens de embryogenese. Hier presenteren we een installatie van optisch pincet gekoppeld aan een lichte blad Microscoop, waarmee direct toepassen krachten op cel contacten van het vroege embryo van de Drosophila , terwijl beeldvorming bij een snelheid van verschillende frames per seconde. Deze techniek heeft het voordeel dat het niet nodig de injectie van parels in het embryo, meestal gebruikt als tussenliggende sondes waarop optische krachten worden uitgeoefend. We stap voor stap de uitvoering van de installatie in detail te beschrijven, en voorstellen voor methoden om mechanische informatie extract van de experimenten. Door het toezicht op de verplaatsingen van cel-cel contactpersonen in real time, kan een spanning metingen uitvoeren en cel contacten reologie onderzoeken.
Introduction
Embryonale ontwikkeling is een zeer reproduceerbaar proces waarin de cellen en weefsels vervormen om het toekomstige dier vorm te geven. Dergelijke vervormingen hebben aangetoond dat vereist de actieve generatie van krachten op de cel niveau1,2. Om te begrijpen morfogenetische processen waarin cellen en weefsels hun vorm wijzigen, is daarom sleutel tot het beoordelen van de mechanische eigenschappen van de cellen die betrokken zijn, en voor het meten van de krachten binnen het weefsel tijdens het proces3,4 . Epitheelweefsel lagen, met name in Drosophila, hebben grote schaal onderzocht als gevolg van hun quasi-2D-geometrie en hun gemakkelijke manipulatie.
Een aantal technieken hebben dus ontwikkeld door ons en anderen om te beoordelen epitheliale mechanica in vivo tijdens de ontwikkeling. Zullen wij een snel overzicht van de drie belangrijkste technieken gebruikt in epitheliale weefsels. Laser ablatie, een veel gebruikte methode, maakt het mogelijk om het onthullen van de lokale mechanische stress op cel kruispunten5,6,7,8 of op grotere schaal9,10,11 door het uitvoeren van lokale bezuinigingen die de mechanische integriteit van het doel verstoren. De dynamiek van de opening na de cut vindt u informatie over de voorafgaande ablatie van stress, zowel de reologie van het weefsel12,13. Een nadeel van laser ablatie is dat het invasieve, daar het vereist dat de lokale verstoring van de cortex van de cel. Vandaar, kan een alleen een beperkt aantal ablations uitvoeren, als men wil weefsel integriteit behouden blijft. Een ander nadeel is dat ablations alleen schattingen op te relatieve van spanning op de contacten van de cel, leveren omdat de opening snelheid is afhankelijk van viskeuze wrijving, dat over het algemeen niet bekend is. Magnetische manipulatie heeft ook ontwikkeld en gebruikt in Drosophila, waarbij het gebruik van ferrofluids14 of15van de ultramagnetic liposomen. Ze bieden absolute metingen16,17, maar zijn ook invasief in de zin dat zij de injectie van sondes op de gewenste locatie vereisen. Dit kan erg lastig zijn afhankelijk van het systeem, dat niet altijd vatbaar voor precieze injecties is. Een derde techniek, volledig niet-invasieve, is kracht gevolgtrekking18,19,20. Kracht gevolgtrekking is gebaseerd op de veronderstelling van mechanisch evenwicht op driedubbele punten (tricellular verbindingen, of hoekpunten) en kunt afleiden spanningen helemaal cel contacten (en eventueel druk in alle cellen) door een omgekeerde probleem op te lossen. Voor spanningen biedt elke vertex twee vergelijkingen (X en Y). Dit levert een grote stelsel van lineaire vergelijkingen, die onder bepaalde omstandigheden te beoordelen van spanning op alle contacten van de cel kan worden omgekeerd. Terwijl deze methode zeer aantrekkelijk, is omdat het vereist alleen een gesegmenteerde afbeelding en geen extra experiment of setup, de juistheid ervan is nog te bepalen, en opnieuw het levert alleen relatieve waarden, tenzij een absolute kalibratie-meting is uitgevoerd.
Om sommige van deze beperkingen te overwinnen, voeren we in dit artikel een opstelling van optisch pincet gekoppeld aan een lichte blad Microscoop toe te passen gecontroleerde krachten op de schaal van de cel in de embryonale epitheel van Drosophila melanogaster. Optisch pincet zijn gebruikt voor tal van biologische toepassingen met inbegrip van de metingen op één eiwitten en manipulatie van organellen en cellen21. Hier, rapporteren we toegepaste krachten in de range van een paar dozijn pN, die klein is nog voldoende induceren van lokale deformaties van mobiele contacten en mechanische metingen in vivouitvoeren. Wij gebruiken meestal loodrecht doorbuiging van cel contacten, gevolgd door de analyse van kymographs, kracht op vervorming. Nog belangrijker is, vereist onze opstelling geen injectie van kralen op de gewenste locatie in het weefsel, aangezien optisch pincet kunnen direct oefenen krachten op cel contacten. De koppeling van de optisch pincet om een lichte blad Microscoop kan men voor het uitvoeren van snelle beeldvorming (aantal frames per seconde), die zeer merkbaar voor een mechanische analyse op korte tijd schalen, en met beperkte fototoxiciteit, sinds de verlichting van is de monster is beperkt tot het vlak van imaging22.
Algemene, optisch pincet zijn een niet-invasieve manier toe te passen gecontroleerde krachten op cel contacten in vivo in de Drosophila embryo, en mechanische gegevens zoals stijfheid en spanning op cel contacten23, Rheologische eigenschappen extraheren 24, en verloop- of anisotropie van spanning23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Optisch pincet wil absolute mechanische metingen rechtstreeks in de ontwikkelingslanden embryonale epitheel uitvoeren op een niet-invasieve wijze. In die zin presenteert het voordelen ten opzichte van andere methoden zoals laser ablatie, die zijn invasief en verstrekken van relatieve metingen, magnetische krachten, waarvoor injecties, of dwingen gevolgtrekking, die gebaseerd op sterke veronderstellingen is en bieden ook relatieve metingen.
Het protocol bevat een paar kritische stappen. Eerst, …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door een FRM Equipe Grant FRM DEQ20130326509, Agence Nationale de la Recherche ANR-Blanc Grant, Morfor ANR-11-BSV5-0008 (op P.-F.L.). Wij erkennen de Frankrijk-BioImaging infrastructuur ondersteund door het Franse nationale Research Agency (ANR-10-INBS-04-01, «Investeringen voor de toekomst»). Wij danken Brice Detailleur en Claude Moretti van de PICSL-FBI-infrastructuur voor technische bijstand.
Materials
| Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW | IPG Laser | YLM-10-LP-SC | including collimator LP : beam D=1.6 mm and red guide laser |
| Ø1/2" Optical Beam Shutter | Thorlabs | SH05 | |
| Small Beam Diameter Galvanometer Systems | Thorlabs | GVS001 | 1 for X displacement, 1 for Y displacement |
| 1D or 2D Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | galvanometers power supply |
| 2 lenses f = 30mm | Thorlabs | LB1757-B | relay telescope between 2 galva |
| Lens f = 200mm | Thorlabs | LB1945-B | 2.5X telescope |
| Lens f = 500mm | Thorlabs | LB1869-B | 2.5X telescope |
| Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes | Thorlabs | KCB1E | Periscope |
| Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style | Thorlabs | LG1 | |
| 45° AOI, 50.0mm Diameter, Hot Mirror | Edmund Optics | #64-470 | |
| Multiphoton-Emitter HC 750/S | AHF | HC 750/SP | |
| CompactDAQ Chassis | National Instruments | cDAQ-9178 | |
| C Series Voltage Output Module | National Instruments | NI-9263 | Analog output module |
| C Series Voltage Input Module | National Instruments | NI-9215 | Analog input module |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 µm, red fluorescent (580/605), 2% solids | ThermoFisher Scientific | F8812 | calibration beads |
| C++ (Qt) home made optical tweezers software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès. Alternative solution: labview |
Referencias
- Lecuit, T., Lenne, P. -. F., Munro, E. Force generation, transmission, and integration during cell and tissue morphogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 27 (1), 157-184 (2011).
- Heisenberg, C. -. P., Bellaïche, Y. Forces in tissue morphogenesis and patterning. Cell. 153 (5), 948-962 (2013).
- Sugimura, K., Lenne, P. -. F., Graner, F. Measuring forces and stresses in situ in living tissues. Development. 143 (2), 186-196 (2016).
- Campàs, O. A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues. Seminars in cell & developmental biology. 55, 119-130 (2016).
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. Journal of Cell Biology. 149 (2), 471-490 (2000).
- Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing. Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).
- Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nature Cell biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).
- Ma, X., Lynch, H. E., Scully, P. C., Hutson, M. S. Probing embryonic tissue mechanics with laser hole drilling. Physical Biology. 6 (3), 036004 (2009).
- Hutson, M. S., Tokutake, Y., et al. Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling. Science. 300 (5616), 145-149 (2003).
- Bonnet, I., Marcq, P., Bosveld, F., Fetler, L., Bellaïche, Y., Graner, F. Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9 (75), 2614-2623 (2012).
- Etournay, R., Popović, M., et al. Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing. eLife. 4, e07090 (2015).
- Rauzi, M., Lenne, P. -. F. Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis. Current topics in developmental biology. 95, 93-144 (2011).
- Saha, A., Nishikawa, M., Behrndt, M., Heisenberg, C. -. P., Jülicher, F., Grill, S. W. Determining Physical Properties of the Cell Cortex. Biophysical journal. 110 (6), 1421-1429 (2016).
- Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. A., Beaurepaire, E., Farge, E. Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos. Developmental cell. 15 (3), 470-477 (2008).
- Mitrossilis, D., Röper, J. -. C., et al. Mechanotransductive cascade of Myo-II-dependent mesoderm and endoderm invaginations in embryo gastrulation. Nature Communications. 8, 13883 (2017).
- Campàs, O., Mammoto, T., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2013).
- Serwane, F., Mongera, A., et al. In vivo quantification of spatially varying mechanical properties in developing tissues. Nature Methods. 14 (2), 181-186 (2017).
- Chiou, K. K., Hufnagel, L., Shraiman, B. I. Mechanical stress inference for two dimensional cell arrays. PLoS computational biology. 8 (5), e1002512 (2012).
- Ishihara, S., Sugimura, K. Bayesian inference of force dynamics during morphogenesis. Journal of theoretical biology. 313, 201-211 (2012).
- Brodland, G. W., Veldhuis, J. H., Kim, S., Perrone, M., Mashburn, D., Hutson, M. S. CellFIT: a cellular force-inference toolkit using curvilinear cell boundaries. PLoS ONE. 9 (6), e99116 (2014).
- Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 247-285 (1994).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Bambardekar, K., Clément, R., Blanc, O., Chardès, C., Lenne, P. -. F. Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).
- Clément, R., Dehapiot, B., Collinet, C., Lecuit, T., Lenne, P. -. F. Viscoelastic Dissipation Stabilizes Cell Shape Changes during Tissue Morphogenesis. Current biology: CB. 27 (20), (2017).
- Chardès, C., Ménélec, P., Bertrand, V., Lenne, P. -. F. Setting-up a simple light sheet microscope for in toto imaging of C. elegans development. Journal of visualized experiments. 87, e51342 (2014).
- Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).
- Cavey, M., Lecuit, T. Imaging Cellular and Molecular Dynamics in Live Embryos Using Fluorescent Proteins. Drosophila. 420, 219-238 (2008).
