Sondeo de la célula mecánica con pinzas ópticas libres de grano en el embrión de Drosophila
Summary
Presentamos una instalación de pinza óptica acoplada a un microscopio de la ficha técnica de iluminación y su aplicación a la punta de prueba mecánica de la célula sin cuentas en el embrión de Drosophila .
Abstract
Morfogénesis requiere coordinación entre patrones genéticos y las fuerzas mecánicas a robusta forma de las células y los tejidos. Por lo tanto, es un reto entender procesos morfogenéticos directamente medir fuerzas celulares y propiedades mecánicas en vivo durante la embriogénesis. Aquí, presentamos un programa de instalación de pinza óptica acoplada a un microscopio de la ficha técnica de iluminación, que permite para aplicar directamente las fuerzas en los contactos de la célula del embrión temprano de Drosophila , mientras que la proyección de imagen a una velocidad de varios fotogramas por segundo. Esta técnica tiene la ventaja que no requiere la inyección de granos en el embrión, generalmente utilizado como sondas intermedias en el cual se ejercen las fuerzas ópticas. Detalle paso a paso la aplicación de la configuración y proponer herramientas para extraer información mecánica de los experimentos. Mediante el control de los desplazamientos de los contactos de la célula en tiempo real, uno puede realizar mediciones de tensión e investigar la reología de los contactos de la célula.
Introduction
Desarrollo embrionario es un proceso altamente reproducible durante el cual las células y los tejidos se deforman para dar forma a los futuros animales. Tales deformaciones han demostrado requerir la generación activa de las fuerzas de la célula nivel1,2. Para entender procesos morfogenéticos durante el cual las células y los tejidos cambian su forma, por lo tanto es clave para evaluar las propiedades mecánicas de las células involucradas y para medir las fuerzas dentro del tejido durante el proceso3,4 . Capas epiteliales, especialmente en Drosophila, se han estudiado ampliamente debido a su geometría de quasi-2D y a su fácil manipulación.
Así, un número de técnicas ha sido desarrollado por nosotros y otros para evaluar mecánica epitelial en vivo durante el desarrollo. Daremos un repaso rápido de las tres principales técnicas utilizadas en los tejidos epiteliales. Ablación con láser, un método ampliamente utilizado, permite revelar la tensión mecánica local en célula ensambladuras5,6,7,8 o en mayor escala9,10,11 mediante la realización de cortes locales que alteran la integridad mecánica del objetivo. La dinámica de la apertura tras el corte proporciona información sobre la ablación previa de estrés tanto en la reología del tejido12,13. Un inconveniente de la ablación láser es que es invasiva, ya que requiere la interrupción local de la corteza de la célula. Por lo tanto, sólo uno puede realizar un número limitado de ablaciones, si quiere preservar la integridad del tejido. Otro inconveniente es que ablaciones sólo proporcionan estimaciones relativas de la tensión en los contactos del celular, ya que la velocidad de apertura depende de la fricción viscosa, que generalmente no se conoce. Manipulación magnética también ha desarrollado y utilizado en Drosophila, que implican el uso de ferrofluidos14 o liposomas ultramagnetic15. Puede proporcionar medidas absolutas16,17, pero también son invasoras en el sentido que requieren la inyección de las puntas de prueba en el lugar deseado. Esto puede ser muy complicado dependiendo del sistema, que no siempre es sensible a las inyecciones precisas. Una tercera técnica, completamente no-invasivo, es fuerza de inferencia18,19,20. Fuerza de inferencia se basa en la suposición de equilibrio mecánico en puntos triples (tricellular nudos o vértices) y permite para deducir las tensiones en todo célula contactos (y posiblemente, las presiones en todas las células) por resolver un problema inverso. Para las tensiones, cada vértice proporciona dos ecuaciones (X e Y). Esto produce un gran sistema de ecuaciones lineales que puede ser invertida bajo ciertas condiciones para evaluar la tensión en todos los contactos de la célula. Mientras que este método es muy atractivo, ya que sólo no requiere una imagen segmentada y experimento adicional o configuración, su exactitud está aún por determinar, y otra vez sólo proporciona valores relativos, a menos que una medida de calibración absoluta se realiza.
Para superar algunas de estas limitaciones, presentamos en este artículo la configuración de pinza óptica acoplada a un microscopio de la ficha técnica de iluminación a aplicar fuerzas controladas a escala celular en el epitelio embrionario de Drosophila melanogaster. Pinza óptica se han utilizado para numerosas aplicaciones biológicas incluyendo las mediciones de proteínas solo y la manipulación de células y organelos21. Aquí, Divulgamos a fuerzas aplicadas en la gama de algunos docena pN, que es pequeño pero suficiente para inducir deformaciones locales de contacto y realizar mediciones mecánicas en vivo. Por lo general, utilizamos desviación perpendicular de contacto, monitoreados a través del análisis de kymographs, relacionarse con fuerza a la deformación. Lo importante, nuestro programa de instalación no requiere la inyección de granos en el lugar deseado en el tejido, pinzas ópticas son capaces de ejercer directamente las fuerzas en los contactos célula-célula. El acoplamiento de las pinzas ópticas para un microscopio de luz hoja permite realizar rápida proyección de imagen (varios fotogramas por segundo), que es muy apreciable para un análisis mecánico en escalas de tiempo corto y con menor fototoxicidad, desde la iluminación de la muestra se limita al plano de proyección de imagen22.
Pinzas en generales, ópticas son una forma no invasiva para aplicar fuerzas controladas en contacto in vivo en el embrión de Drosophila y extraer información mecánica como rigidez y tensión en celular contactos23, propiedades reológicas 24y gradiente o anisotropía de tensión23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pinzas ópticas permiten para realizar mediciones mecánicas absolutas directamente en el epitelio embrionario en desarrollo de una manera no invasiva. En ese sentido, presenta ventajas sobre otros métodos como la ablación del laser, que son invasivos y proporcionan mediciones relativas, fuerzas magnéticas, que requieren inyecciones, o fuerza de inferencia, que se basa en suposiciones fuertes y también proporcionan relativa mediciones.
El protocolo incluye algunos pasos críticos. En prime…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por un FRM Equipe beca FRM DEQ20130326509, Agence Nationale de la Recherche de ANR-Blanc de Grant, Morfor ANR-11-BSV5-0008 (al P.-F.L.). Reconocemos Francia-Bioimagen infraestructura apoyado por el francés Agencia Nacional de investigación (ANR-10-INBS-04-01, «Las inversiones para el futuro»). Agradecemos a Brice Detailleur y Claude Moretti de la infraestructura de PICSL-FBI para asistencia técnica.
Materials
| Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW | IPG Laser | YLM-10-LP-SC | including collimator LP : beam D=1.6 mm and red guide laser |
| Ø1/2" Optical Beam Shutter | Thorlabs | SH05 | |
| Small Beam Diameter Galvanometer Systems | Thorlabs | GVS001 | 1 for X displacement, 1 for Y displacement |
| 1D or 2D Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | galvanometers power supply |
| 2 lenses f = 30mm | Thorlabs | LB1757-B | relay telescope between 2 galva |
| Lens f = 200mm | Thorlabs | LB1945-B | 2.5X telescope |
| Lens f = 500mm | Thorlabs | LB1869-B | 2.5X telescope |
| Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes | Thorlabs | KCB1E | Periscope |
| Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style | Thorlabs | LG1 | |
| 45° AOI, 50.0mm Diameter, Hot Mirror | Edmund Optics | #64-470 | |
| Multiphoton-Emitter HC 750/S | AHF | HC 750/SP | |
| CompactDAQ Chassis | National Instruments | cDAQ-9178 | |
| C Series Voltage Output Module | National Instruments | NI-9263 | Analog output module |
| C Series Voltage Input Module | National Instruments | NI-9215 | Analog input module |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 µm, red fluorescent (580/605), 2% solids | ThermoFisher Scientific | F8812 | calibration beads |
| C++ (Qt) home made optical tweezers software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès. Alternative solution: labview |
Referencias
- Lecuit, T., Lenne, P. -. F., Munro, E. Force generation, transmission, and integration during cell and tissue morphogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 27 (1), 157-184 (2011).
- Heisenberg, C. -. P., Bellaïche, Y. Forces in tissue morphogenesis and patterning. Cell. 153 (5), 948-962 (2013).
- Sugimura, K., Lenne, P. -. F., Graner, F. Measuring forces and stresses in situ in living tissues. Development. 143 (2), 186-196 (2016).
- Campàs, O. A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues. Seminars in cell & developmental biology. 55, 119-130 (2016).
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. Journal of Cell Biology. 149 (2), 471-490 (2000).
- Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing. Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).
- Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nature Cell biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).
- Ma, X., Lynch, H. E., Scully, P. C., Hutson, M. S. Probing embryonic tissue mechanics with laser hole drilling. Physical Biology. 6 (3), 036004 (2009).
- Hutson, M. S., Tokutake, Y., et al. Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling. Science. 300 (5616), 145-149 (2003).
- Bonnet, I., Marcq, P., Bosveld, F., Fetler, L., Bellaïche, Y., Graner, F. Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9 (75), 2614-2623 (2012).
- Etournay, R., Popović, M., et al. Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing. eLife. 4, e07090 (2015).
- Rauzi, M., Lenne, P. -. F. Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis. Current topics in developmental biology. 95, 93-144 (2011).
- Saha, A., Nishikawa, M., Behrndt, M., Heisenberg, C. -. P., Jülicher, F., Grill, S. W. Determining Physical Properties of the Cell Cortex. Biophysical journal. 110 (6), 1421-1429 (2016).
- Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. A., Beaurepaire, E., Farge, E. Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos. Developmental cell. 15 (3), 470-477 (2008).
- Mitrossilis, D., Röper, J. -. C., et al. Mechanotransductive cascade of Myo-II-dependent mesoderm and endoderm invaginations in embryo gastrulation. Nature Communications. 8, 13883 (2017).
- Campàs, O., Mammoto, T., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2013).
- Serwane, F., Mongera, A., et al. In vivo quantification of spatially varying mechanical properties in developing tissues. Nature Methods. 14 (2), 181-186 (2017).
- Chiou, K. K., Hufnagel, L., Shraiman, B. I. Mechanical stress inference for two dimensional cell arrays. PLoS computational biology. 8 (5), e1002512 (2012).
- Ishihara, S., Sugimura, K. Bayesian inference of force dynamics during morphogenesis. Journal of theoretical biology. 313, 201-211 (2012).
- Brodland, G. W., Veldhuis, J. H., Kim, S., Perrone, M., Mashburn, D., Hutson, M. S. CellFIT: a cellular force-inference toolkit using curvilinear cell boundaries. PLoS ONE. 9 (6), e99116 (2014).
- Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 247-285 (1994).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Bambardekar, K., Clément, R., Blanc, O., Chardès, C., Lenne, P. -. F. Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).
- Clément, R., Dehapiot, B., Collinet, C., Lecuit, T., Lenne, P. -. F. Viscoelastic Dissipation Stabilizes Cell Shape Changes during Tissue Morphogenesis. Current biology: CB. 27 (20), (2017).
- Chardès, C., Ménélec, P., Bertrand, V., Lenne, P. -. F. Setting-up a simple light sheet microscope for in toto imaging of C. elegans development. Journal of visualized experiments. 87, e51342 (2014).
- Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).
- Cavey, M., Lecuit, T. Imaging Cellular and Molecular Dynamics in Live Embryos Using Fluorescent Proteins. Drosophila. 420, 219-238 (2008).
