JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Traducción Automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biología

Лактатдегидрогеназа Assay поглощение — Простой и надежный метод для определения активности сыпучих Autophagic поглощения в клетках млекопитающих

Published: July 27, 2018
doi:
10.3791/57971
, ,
1The Autophagy Team, Centre for Molecular Medicine Norway (NCMM), Nordic EMBL Partnership,University of Oslo

Summary

Здесь описан простой и хорошо проверенных протокол для измерения активности сыпучих autophagic поглощения в mammalian клетках. Метод основан на количественной оценки доли Лактатдегидрогеназа (LDH) в sedimentable клеток фракций по сравнению с общей сотовой уровня ЛДГ.

Abstract

Основная autophagy характеризуется поглощение значительная часть цитоплазмы в двойной/multi-membrane структуры, называют autophagosomes. Здесь описан простой протокол для контролировать этот процесс. Кроме того предоставляются типичные результаты и экспериментальной проверки метода autophagy склонение в условиях различных видов культивируемых клеток млекопитающих. Во время массовых autophagy autophagosomes секвестрировать в цитозоле и таким образом также растворимые цитозольной белков, наряду с другими autophagic груза. LDH является стабильной и очень обильные, растворимые цитозольной фермента, который неизбирательно поглощенных в autophagosomes. Таким образом, количество ЛДГ поглощение отражает количество массовых autophagic поглощения. Эффективно и точно определить уровень ЛДГ поглощения в клетках, мы используем протокол на основе electrodisruption фракционирования, который эффективно отделяет sedimentable от цитозольной ЛДГ, следуют измерения ферментативной активности в sedimentable фракции против поклеточного образцы. Autophagic поглощение определяется путем вычитания доли sedimentable ЛДГ в необработанной клеток из что в обработанных клеток. Преимущество пробирного поглощение ЛДГ, что это дает количественную меру autophagic поглощения эндогенного грузов, в отличие от других методов либо привлекать внематочная выражение связывания зондов или полуколичественного протеазы анализ защиты autophagy маркеры или рецепторов.

Introduction

Autophagy (по-гречески «самостоятельной питания») является эволюционным процессом сохранены для вакуолярной/лизосомальных деградации внутриклеточных материала. После обнаружения связанных с autophagy («ГПТ») генов, которые являются важными для autophagy дрожжей и людей, и реализации что autophagy играет значительную роль в здоровье и болезни (подтверждено 2016 Нобелевской премии в области медицины или физиологии, чтобы Ёсинори Ohsumi), autophagy быстро стал одним из наиболее интенсивно изучаемых процессов в ячейки биологии1,2.

Macroautophagy (в дальнейшем именуемый «autophagy») характеризуется расширением и складной из межклеточная внутриклеточные мембраны («phagophores») в запечатанных, двойной или multi membrane структуры («autophagosomes»), которые эффективно поглощать enwrapped материал от остальной части цитоплазме. После слияния autophagosomes с лизосомы внутренний autophagosomal мембраны и поглощенных груз деградации и переработанных. Autophagosomes может поглощать цитоплазматических материал в случайных (неизбирательной autophagy) и манеры селективный (селективный autophagy). Основная autophagy скорее представляет собой смесь неизбирательной и селективного autophagy.

В 1960-х и 70-х годов («морфологические эра» autophagy исследований) autophagic поглощение оценивалось главным образом через ультраструктурных анализы. В 1980-х и начале 1990-х годов («биохимических эра») в Seglen и коллегами — кто изучал autophagy в первичной крыса гепатоцитов — разработал первый методы количественно измерить autophagic поглощение деятельности3. С помощью этих анализов, Seglen определены и охарактеризовал различные шаги autophagic лизосомальных пути4,5, обнаружил и придумал amphisome6 (продукт синтеза endosome-autophagosome) и был первым Опишите роль фосфорилирование белков в autophagy регулирование7. Однако, после обнаружения АТГС в 1990-х годов («молекулярная эра») и первая характеристика млекопитающих ATG8 белка, микротрубочки связанные белком 1A/1B-свет цепь 3 (LC3) в 2000 году8, использование ГПТ белков в качестве маркеров для autophagic процесс быстро завоевал популярность, и старше и более трудоемкий биохимические методы были выйдены позади. В самом деле, за последние 18 лет, Западная помарка и анализ микроскопии флуоресцирования LC3 стали на сегодняшний день наиболее популярные (и во многих случаях единственным) средства изучения autophagy в клетках млекопитающих. Преимуществом является относительная простота, в которой может осуществляться эти методы. Недостатком является то, что один учится корзину компонент (LC3) вместо фактических autophagic грузов. Это довольно серьезный недостаток, потому что отношения между государствами и/или потока LC3 через путь против поглощения и потока грузов весьма неясным. В самом деле, мы показали, что потока сыпучих грузов может поддерживаться на высоком уровне в условиях там, где нет LC3 потока, несмотря на присутствие конъюгированных LC3 в клетки9. Кроме того мы показали, что основная autophagy не зависит от эффективной LC3 истощения и таким образом вероятно LC3-независимые9. Этот вывод был позднее подтвержден LC3 исследования нокаут-10,11, которые также указывают, что Паркин зависимой mitophagy (селективный autophagy митохондрий) является независимым от LC310,11 .

Таким образом, существует явная необходимость грузов на основе анализов для мониторинга autophagic активности. Оптимально такие анализы должны быть широко применимы, четкие и легко выполнять. За последние несколько лет мы имели особый интерес в assay поглощение ЛДГ, который был разработан в Seglen в 1980-х12и основан на измерении передачи цитозольной ЛДГ sedimentable, autophagic вакуоль содержащих клеток фракции. LDH является стабильной, растворимые цитозольной белок, который легко совместно поглощенных при phagophores завертывать цитоплазматических грузов. Поглощение ЛДГ поэтому является мерой общего autophagic поглощения. LDH исключительно деградации autophagic лизосомальных пути12. Таким образом, в присутствии ингибиторов лизосомальных деградации, например, bafilomycin A1 (Baf)13, экспериментальное лечение эффекты непосредственно отражают изменения в деятельности autophagic поглощения. В отсутствие деградации ингибиторы чистый эффект изменений в ЛДГ поглощение и деградация может быть измерена.

Assay поглощение ЛДГ широко применимым, поскольку ЛДГ выражается высоко и повсеместно, во всех типах клеток, и ЛДГ уровни могут быть точно количественно ферментативные пробирного14,15. Однако, оригинал протокола12 — в первичной крыса гепатоцитов — довольно много времени и требует большого количества начиная материала, а также по индивидуальному заказу электрического разряда конденсатора. На основе поэтапного мы постепенно превратили assay в легкий и универсальный метод. Во-первых оригинальный протокол был адаптирован для использования в mammalian клетки линии16. Во-вторых метод был значительно уменьшенным разрешением3,9. В-третьих, несколько шагов в протоколе были ликвидированы, включая трудоемкий плотность подушке шаг17. Это одновременно позволило еще больше разукрупнение метода, от оригинального отправной точкой использованием плита 10 см за образец16 один колодец от 12-ну пластины на сэмпл (то есть, около 15 раз меньше начиная материал)17. В-четвертых мы определили коммерческий электропорации аппарат, который может заменить на заказ электрическим разрядом конденсатора17.

Здесь представлены наши самые современные протокол assay поглощение ЛДГ, который включает в себя некоторые дальнейшего упрощения метода по сравнению с ранее опубликованной17 . Кроме того показан набор типичных результаты, полученные в ряде различных типов клеток, и главное, предоставляются несколько строк экспериментальной проверки метода с использованием фармакологических, а также генетические сногсшибательно и нокаут подходы. Общая схема всего протокола см. Рисунок 1.

Protocol

1. клетки посева и лечение Культура адэрентных клеток в колбах культуры ткани2 75 см в увлажненные инкубатор с 5% CO2 при 37 ° C, с использованием предпочтительного питательной среды для типа ячейки в вопросе. Позволяют клеткам расти до тех пор, пока они достигают слоя кл?…

Representative Results

С помощью протокола описанных здесь, основная autophagic поглощение активности в ряде различных млекопитающих клеточных линий, включая LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, HeLa, VCaP, H3122, Hec1A, MCF-7, T47D, U2OS, PC3, G361, мышь эмбриональных фибробластов (MEFs), ПЭС-1, HEK293, BJ и LNCaP клетки была измерена. Поглощение оцен…

Discussion

В резюме протокол, описанные здесь представляет собой надежный и широко применяется метод для мониторинга активности сыпучих autophagic поглощения в mammalian клетках. По сравнению с оригинальной метод12,16, мы удалены несколько лишних шагов, упрощенный несколько …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была финансовую поддержку научно-исследовательский совет Норвегии, в Университете Осло, фонда Anders Jahre, Фонд Нансена и наследие в памяти Хенрик Homan. Мы благодарим д-р Нобору Mizushima для ATG5 +/ + MEFs и ATG5-/-MEFs, доктор Масааки Komatsu для ATG7 +/ + MEFs и ATG7/MEFs и доктор Сидзуо Akira для ATG9A +/ + MEFs и ATG9A/MEFs. Мы благодарим Фрэнк Sætre для оказания технической помощи и д-р за Seglen O. для конструктивного обсуждения методологических.

Materials

1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes  Eppendorf 211-2130 and 211-2120
12-well plates  Falcon 353043
Accumax  cell detachment solution Innovative Cell Technologies A7089 Keep aliquots at -20 °C for years, and in fridge for a few months
Bafilomycin A1 Enzo BML-CM110-0100 Dissolve in DMSO
BJ cells ATCC CRL-2522 use at passage <30
Bovine serum albumin (BSA) VWR 422361V
Burker counting chamber Fisher Scientific 139-658585
Countess Cell Counting Chamber Slides ThermoFisher Scientfic C10228
Countess II Automated Cell Counter ThermoFisher Scientfic AMQAX1000
Cover glass for the Burker counting chamber Fisher Scientific 139-658586
Criterion Tris-HCl Gel, 4–20%, 26-well, 15 µl, 13.3 x 8.7 cm (W x L)  Bio-Rad 3450034
DTT Sigma-Aldrich D0632
Earle's balanced salt solution (EBSS) Gibco 24010-043 conatains 0.1% glucose
EDTA Sigma-Aldrich E7889
Electroporation cuvette (4 mm) Bio-Rad 1652088
Exponential decay wave electroporator BTX Harvard Apparatus  EMC 630
Fetal bovine serum (FBS) Sigma F7524 10% final concentration in RPMI 1640 medium
HEK293 cells ATCC CRL-1573
Imidazole Sigma-Aldrich 56750 Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months
Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator NuAire NU-5510E
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent ThermoFisher 13778150
LNCaP cells ATCC CRL-1740 use at passage <30
3-Methyl Adenine (3MA) Sigma-Aldrich M9281 Stock 100 mM in RPMI in -20 °C.  Heat stock to 65 °C for 10 minutes, and use at 10 mM final concentration
Refridgerated Microcentrifuge Beckman Coulter Life Sciences 368831
Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function Eppendorf  Eppendorf 5417R 
MRT67307 hydrochloride (ULKi) Sigma-Aldrich SML0702 Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO.
MaxMat Multianalyzer instrument Erba Diagnostics PL-II
MCF7 cells ATCC HTB-22
NADH Merck-Millipore 1.24644.001
Nycodenz Axis-Shield 1002424
Opti-MEM Reduced Serum Medium ThermoFisher 31985062
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 20012-019
Pipette tips 3 (0.5-20 µl) VWR 732-2223 Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipette tips (1-200 µl) VWR 732-2207  Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipette tips (100-1000µl) VWR 732-2355  Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipettes ThermoFisher 4701070 Finnpipette F2 GLP Kit
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407-10X5MG Make a 1 mg/ml stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 °C for at least 1 year.
Pyruvate Merck-Millipore 1066190050
RPE-1 cells (hTERT RPE-1) ATCC CRL-4000
RPMI 1640 Gibco 21875-037
SAR-405 ApexBio  A8883 Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO.
Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl) ThermoFisher/Ambion 4390843
Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A) ThermoFisher/Ambion s35504
Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200) ThermoFisher/Ambion s18995
Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1) ThermoFisher/Ambion s15964
Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2) ThermoFisher/Ambion s18705
Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP) ThermoFisher/Ambion s22362
Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1) ThermoFisher/Ambion s24333
Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2) ThermoFisher/Ambion s22387
Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 • 2H2O)  Merck-Millipore 1.06580.1000
Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 • 2H2O )  Prolabo 28014.291
Sucrose VWR 443816T 10% final concentration in water; filter through 0.45 µm filter and keep in fridge for months
Thapsigargin Sigma-Aldrich T9033 Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO.
Triton X-405  Sigma-Aldrich X405 1% final
Trypan Blue stain 0.4% Molecular Probes T10282
Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin) Gibco 25200-056
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287 0.01% final
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Rubinsztein, D. C., Frake, R. A. Yoshinori Ohsumi’s Nobel Prize for mechanisms of autophagy: from basic yeast biology to therapeutic potential. J R Coll Physicians Edinb. 46 (4), 228-233 (2016).
  2. Mizushima, N. The exponential growth of autophagy-related research: from the humble yeast to the Nobel Prize. FEBS Lett. 591 (5), 681-689 (2017).
  3. Seglen, P. O., et al. Macroautophagic cargo sequestration assays. Methods. 75, 25-36 (2015).
  4. Hoyvik, H., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Use of a hydrolysable probe, [14C]lactose, to distinguish between pre-lysosomal and lysosomal steps in the autophagic pathway. Exp Cell Res. 166 (1), 1-14 (1986).
  5. Plomp, P. J., Gordon, P. B., Meijer, A. J., Hoyvik, H., Seglen, P. O. Energy dependence of different steps in the autophagic-lysosomal pathway. J Biol Chem. 264 (12), 6699-6704 (1989).
  6. Gordon, P. B., Seglen, P. O. Prelysosomal convergence of autophagic and endocytic pathways. Biochem Biophys Res Commun. 151 (1), 40-47 (1988).
  7. Holen, I., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Protein kinase-dependent effects of okadaic acid on hepatocytic autophagy and cytoskeletal integrity. Biochem J. 284, 633-636 (1992).
  8. Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. Embo j. 19 (21), 5720-5728 (2000).
  9. Szalai, P., et al. Autophagic bulk sequestration of cytosolic cargo is independent of LC3, but requires GABARAPs. Exp Cell Res. 333 (1), 21-38 (2015).
  10. Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. J Cell Biol. , (2016).
  11. Pontano Vaites, L., Paulo, J. A., Huttlin, E. L., Harper, J. W. Systematic analysis of human cells lacking ATG8 proteins uncovers roles for GABARAPs and the CCZ1/MON1 regulator C18orf8/RMC1 in macro and selective autophagic flux. Mol Cell Biol. , (2017).
  12. Kopitz, J., Kisen, G. O., Gordon, P. B., Bohley, P., Seglen, P. O. Nonselective autophagy of cytosolic enzymes by isolated rat hepatocytes. J Cell Biol. 111 (3), 941-953 (1990).
  13. Bowman, E. J., Siebers, A., Altendorf, K. Bafilomycins: a class of inhibitors of membrane ATPases from microorganisms, animal cells, and plant cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (21), 7972-7976 (1988).
  14. Hadjivassiliou, A. G., Rieder, S. V. The enzymatic assay of pyruvic and lactic acids. A definitive procedure. Clin Chim Acta. 19 (3), 357-361 (1968).
  15. Bergmeyer, H. U., Bernt, E., Bergmeyer, H. U. . Methods of enzymatic analysis (2nd English ed). 2, 574-579 (1974).
  16. Engedal, N., et al. Modulation of intracellular calcium homeostasis blocks autophagosome formation. Autophagy. 9 (10), 1475-1490 (2013).
  17. Luhr, M., et al. A Simple Cargo Sequestration Assay for Quantitative Measurement of Nonselective Autophagy in Cultured Cells. Methods Enzymol. 587, 351-364 (2017).
  18. Mousavi, S. A., et al. Effects of inhibitors of the vacuolar proton pump on hepatic heterophagy and autophagy. Biochim Biophys Acta. 1510 (1-2), 243-257 (2001).
  19. Seglen, P. O., Gordon, P. B. 3-Methyladenine: specific inhibitor of autophagic/lysosomal protein degradation in isolated rat hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (6), 1889-1892 (1982).
  20. Ronan, B., et al. A highly potent and selective Vps34 inhibitor alters vesicle trafficking and autophagy. Nat Chem Biol. 10 (12), 1013-1019 (2014).
  21. Saetre, F., Hagen, L. K., Engedal, N., Seglen, P. O. Novel steps in the autophagic-lysosomal pathway. Febs j. 282 (11), 2202-2214 (2015).
  22. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
  23. Seglen, P. O., Overbye, A., Saetre, F. Sequestration assays for mammalian autophagy. Methods Enzymol. 452, 63-83 (2009).
  24. Hurley, J. H., Young, L. N. Mechanisms of Autophagy Initiation. Annu Rev Biochem. 86, 225-244 (2017).
  25. Thastrup, O., Cullen, P. J., Drobak, B. K., Hanley, M. R., Dawson, A. P. Thapsigargin, a tumor promoter, discharges intracellular Ca2+ stores by specific inhibition of the endoplasmic reticulum Ca2(+)-ATPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (7), 2466-2470 (1990).
  26. Kuma, A., et al. The role of autophagy during the early neonatal starvation period. Nature. 432 (7020), 1032-1036 (2004).
  27. Komatsu, M., et al. Impairment of starvation-induced and constitutive autophagy in Atg7-deficient mice. J Cell Biol. 169 (3), 425-434 (2005).
  28. Saitoh, T., et al. Atg9a controls dsDNA-driven dynamic translocation of STING and the innate immune response. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20842-20846 (2009).
  29. Gordon, P. B., Seglen, P. O. Autophagic sequestration of [14C]sucrose, introduced into rat hepatocytes by reversible electro-permeabilization. Exp Cell Res. 142 (1), 1-14 (1982).
  30. An, H., Harper, J. W. Systematic analysis of ribophagy in human cells reveals bystander flux during selective autophagy. Nat Cell Biol. 20 (2), 135-143 (2018).
  31. Fass, E., Shvets, E., Degani, I., Hirschberg, K., Elazar, Z. Microtubules support production of starvation-induced autophagosomes but not their targeting and fusion with lysosomes. J Biol Chem. 281 (47), 36303-36316 (2006).
  32. Velikkakath, A. K., Nishimura, T., Oita, E., Ishihara, N., Mizushima, N. Mammalian Atg2 proteins are essential for autophagosome formation and important for regulation of size and distribution of lipid droplets. Mol Biol Cell. 23 (5), 896-909 (2012).
  33. Øverbye, A., Sætre, F., Hagen, L. K., Johansen, H. T., Seglen, P. O. Autophagic activity measured in whole rat hepatocytes as the accumulation of a novel BHMT fragment (p10), generated in amphisomes by the asparaginyl proteinase, legumain. Autophagy. 7 (9), 1011-1027 (2011).
  34. Kominami, E., Hashida, S., Khairallah, E. A., Katunuma, N. Sequestration of cytoplasmic enzymes in an autophagic vacuole-lysosomal system induced by injection of leupeptin. J Biol Chem. 258 (10), 6093-6100 (1983).
  35. Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).
  36. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).
  37. Ogier-Denis, E., et al. A heterotrimeric Gi3-protein controls autophagic sequestration in the human colon cancer cell line HT-29. J Biol Chem. 270 (1), 13-16 (1995).
  38. Seglen, P. O., Gordon, P. B., Tolleshaug, H., Hoyvik, H. Use of [3H]raffinose as a specific probe of autophagic sequestration. Exp Cell Res. 162 (1), 273-277 (1986).
  39. Luhr, M., Sætre, F., Engedal, N. The Long-lived Protein Degradation Assay: an Efficient Method for Quantitative Determination of the Autophagic Flux of Endogenous Proteins in Adherent Cell Lines. Bio-protocol. 8 (9), e2836 (2018).
  40. Ronning, O. W., Pettersen, E. O., Seglen, P. O. Protein synthesis and protein degradation through the cell cycle of human NHIK 3025 cells in vitro. Exp Cell Res. 123 (1), 63-72 (1979).
  41. Seglen, P. O., Grinde, B., Solheim, A. E. Inhibition of the lysosomal pathway of protein degradation in isolated rat hepatocytes by ammonia, methylamine, chloroquine and leupeptin. Eur J Biochem. 95 (2), 215-225 (1979).
  42. Seglen, P. O., Solheim, A. E. Valine uptake and incorporation into protein in isolated rat hepatocytes. Nature of the precursor pool for protein synthesis. Eur J Biochem. 85 (1), 15-25 (1978).
  43. Bauvy, C., Meijer, A. J., Codogno, P. Assaying of autophagic protein degradation. Methods Enzymol. 452, 47-61 (2009).
  44. Engedal, N., Seglen, P. O. Autophagy of cytoplasmic bulk cargo does not require LC3. Autophagy. 12 (2), 1-3 (2016).

Tags

Keywords: Lactate Dehydrogenase Sequestration AssayAutophagyAutophagic SequestrationCell CultureTrypsinCell CountingCell SeedingBafilomycin A1Cell Detachment
check_url/es/57971?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Luhr, M., Szalai, P., Engedal, N. The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay — A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (137), e57971, doi:10.3791/57971 (2018).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image