كاينورهابديتيس غربال: صك التكنولوجيا المنخفضة ومنهجية لفرز الكائنات متعددة الخلايا الصغيرة
Summary
يشمل البروتوكول الحالي منهجية للفرز والتنظيف لمطابقة سن السكان من ايليجانس كاينورهابديتيس. فإنه يستخدم بسيطة وغير مكلفة، وكفاءة أداة مصنوعة خصيصا للحصول على عدد كبير من سكان تجريبية من الديدان الخيطية للبحوث.
Abstract
ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) كائن نموذج راسخة المستخدمة عبر مجموعة من البحوث الطبية الحيوية والأساسية. داخل مجتمع البحوث السلكية، هناك حاجة لطريقة الفعالة والميسورة التكلفة للحفاظ على السكان الكبيرة، وتطابق العمر من C. ايليجانس. وهنا، نقدم منهجية لفرز ميكانيكيا وتنظيف C. ايليجانس. أن هدفنا توفير عملية فعالة من حيث التكلفة، وفعالة وسريعة وبسيطة للحصول على الحيوانات من أحجام موحدة ومراحل الحياة لاستخدامها في التجارب. تستخدم هذه الأداة، غربال كاينورهابديتيس ، نظام غطاء مبنية خصيصا بالمواضيع على المشترك مختبر مخروطية أنابيب ويفرز C. ايليجانس استناداً إلى حجم الجسم. نحن أيضا إثبات أن غربال كاينورهابديتيس ينقل فعالية الحيوانات من لوحة ثقافة واحدة إلى آخر السماح للفرز السريع، مزامنة، وتنظيف دون التأثير على علامات للصحة، بما في ذلك الحركة والإجهاد إيندوسيبلي الصحافيين الجينات. هذه الأداة موجوداً والمبتكرة خيار سريعة وفعالة، وغير مجهدة للحفاظ على السكان C. ايليجانس .
Introduction
الدودة السلكية، ايليجانس كاينورهابديتيس، كائن نموذج رئيس وزراء. بالإضافة إلى الطابع مباشرة والتي تسيطر عليها لزراعتها في المختبر، الجينوم أكمله هو التسلسل1 ويعرف مصير الإنمائية لكل خلية2. بسبب هذه الميزات، C. ايليجانس كائن نموذج مستخدمة على نطاق واسع للدراسات الوراثية. ومع ذلك، جنبا إلى جنب مع هذه الخصائص المفيدة تأتي بعض التحديات للباحثين. سبب وقتهم الجيل السريع، C. ايليجانس السكان يمكن أن تنفد بسرعة الغذاء و/أو تصبح مختلطة السكان مع أجيال متعددة ويقدم مراحل النمو في وقت واحد. وهكذا، تتطلب تجارب أجريت على وسائط النمو السلكية الصلبة (NGM) الباحثين لنقل الحيوانات فعلياً إلى لوحات جديدة قبل أن يستنفد المصدر الغذائي الجرثومي ووضع اليرقات الجديدة. هذا يمكن أن يكون مملا كما نقل متكررة من الحيوانات مطلوب لمنع السكان تجريبية من أن تصبح مختلطة مع الأجيال ذرية. لا يزال، تتطلب بعض التجارب كلا أعدادا كبيرة من الحيوانات والنقاط الزمنية الممتدة (مثلاً، استخراج الحمض النووي الريبي أو في مرحلة البلوغ). وهذا يضاعف التحديات المتمثلة في الحفاظ على عدد سكان متزامنة بدقة ونقل إعداد كبيرة من الحيوانات.
الأساليب الحالية لنقل C. ايليجانس مثقف في NGM الانتقاء أو غسل الحيوانات من لوحة للوحة؛ علاج كيميائيا الحيوانات (مثلاً، مع الحمض النووي النسخ المتماثل مثبط فلوروديوكسيوريديني أو فودر)؛ أو استخدام التدفق الخلوي لفرز الحيوانات في لوحات متعددة جيدا. الانتقاء ينطوي على استخدام أداة اليد، المصنوع من سلك البلاتين رقيقة أو جفن، أما يدوياً نقل الفرد أو3،الحيوانات متعددة4. هذا الأسلوب هو دقيقة ولكن يتطلب المهارة والوقت وهو القيد للدراسات التي تشمل أعدادا كبيرة من الحيوانات. اختيار مايو أيضا أن تكون ضررا جسديا والمجهدة للحيوانات التي يحتمل أن إخضاع الأفراد لكميات غير طبيعية وغير متناسقة من اضطراب وقوة. ينطوي غسيل الشطف طبق ثقافة مع حل المخزن مؤقت ونقل الحل مع الحيوانات عبر الزجاج ماصة باستور إلى لوحة ثقافة جديدة. هذا الأسلوب هو سريعة وفعالة ولكن ليست دقيقة كما يتم نقل متعددة الأجيال والمراحل التنموية للحيوانات بكميات كبيرة. ويمكن حل العلاجات الكيميائية، مثل فودر، في تثقيف وسائل الإعلام لمنع إنتاج ذرية من خلال منع أي تكرار الحمض النووي، ومن ثم، وضع البيض وإنتاج مشيج. وبينما فعالة، يجب أن يكون تطبيق هذا الأسلوب بعد نضوج الإنمائية فيما يتعلق بعدم عرقلة العمليات الإنمائية العادية، وهذا يعني أنه لا يزال هناك شرط لنقل الحيوانات قبل الإدارة3. هذا الأسلوب أيضا تأثيرات متعددة الخلوية مما يشير إلى مسارات، وأسفر عن تأثيرات ملحوظة على الحيوانات مع تقدمهم في السن (مثلاً، بتمديد عمر أو تغيير بروتيوستاسيس) اعتماداً على سلالة C. ايليجانس تستخدم5، 6،،من78،،من910. التدفق الخلوي أساليب الفرز ونقل الفردية C. ايليجانس من لوحة متعددة جيدا واحد إلى آخر11تلقائياً. بينما يكون هذا الأسلوب فعالة وكفؤة جداً، التدفق الخلوي معدات باهظة باهظة الثمن وغير متاحة للعديد من الباحثين. هو بديل لنقل الحيوانات استخدام نماذج المسخ التي تعتبر حساسة، مثل فر-15 و فيم-1، التي أصبحت عقيمة مع ضبط درجة الحرارة12درجة الحرارة. بينما استخدام الحيوانات المسخ مفيد في بعض الحالات، هذه السلالات المحددة تنمو بشكل أبطأ من الحيوانات البرية من نوع وأنهم يعتمدون المجين غيرت، بوصفه ممثلي الفقراء للديدان الشيخوخة أو صحية. وبالإضافة إلى ذلك، يؤدي أيضا إلى الاعتماد على درجة حرارة تحول إلى الحث على العقم في غياب بيئة ثابتة، والتغيرات في درجات الحرارة قد ثبت سهولة التأثير على الجينات تعبيرات13،14، 15-المجموعات البحثية قد نشرت سابقا تقنيات تصف استخدام شبكة لتصفية C. ايليجانس بحجم16. ومع ذلك، كنا غير قادر على العثور على عمل السابقة اختبار أية تغييرات في النتائج الصحية العامة التي قد تكون مرتبطة باستخدام عوامل التصفية هذه.
ومن ثم، هناك حاجة داخل مجتمع البحوث C. ايليجانس طريقة معقولة، فعالة وسريعة ودقيقة لنقل إعداد كبيرة من الحيوانات بين لوحات الثقافة ل. وقد وضعنا قطعة محسنة، يمكن الوصول إليها من المعدات (تسمى غربال كاينورهابديتيس ) وبروتوكول المقترنة لتصنيع وعملية تلبي احتياجات مجتمع البحوث C. ايليجانس . هنا، نشاطر تصميم منخل كاينورهابديتيس وطرق استخدامها، ونظهر أن استخدامها لا تؤثر صحة المشترك أو أي من علامات الإجهاد عند مقارنتها بمعيار الانتقاء اليدوي وعلاج مع شائعة، فودر الكيميائية المقيدة للخصوبة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وهنا، قدمنا تصميم واستخدام غربال كاينورهابديتيس ميسرة وفعالة كأداة للفرز والحفاظ على C. ايليجانس. هذه الأداة ومزايا عدة لانتقاء الحيوانات الفردية، غسل السكان والعلاجات الكيميائية (مثلاً، فودر)، وأساليب أكثر تكلفة من الحيوانات فصل يدوياً. أولاً، منخل كاينورهابديتيس ك?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب يود أن يشكر هيذر كوري لمساهمتها الأولية في تصميم الدراسة، والدكتور سواراب ميترا لبلده استعراض نقدي للمخطوطة. ونود أيضا أن نشكر الدكتور مايكل باء هاريس على التعليقات، والتحسينات والمساعدة في إعداد البيان العملي لهذه المنهجية. وقدمت السلالات كاينورهابديتيس مركز علم الوراثة، والذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة “برامج الهياكل الأساسية للبحوث” (P40 OD010440). وأيد البحث عنها في هذا المنشور بالمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة “معاهد الصحة الوطنية في” إطار جائزة أرقام UL1GM118991 أو TL4GM118992 أو RL5GM118990 وجائزة التنمية المؤسسية (فكرة) من المعهد الوطني للعامة الطبية العلوم من “معاهد الصحة الوطنية في” إطار المنحة رقم 5P20GM103395-15. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية “المعاهد الوطنية للصحة”. تعميم الوصول إلى الخدمات هو AA/EO صاحب العمل والمؤسسة التعليمية، ويحظر التمييز غير المشروع ضد أي فرد: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.
Materials
| Safety glasses | Uline | S-21076 | |
| Protective heat resistant glove | Grainger | Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 14-432-22 | |
| Synthetic Nylon mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd |
NTX20 and NTX50 | |
| Cyanoacrylate glue | Scotch Super Glue Liquid | SAD114 | |
| Pliers | Vampliers | VMPVT-001-8 | |
| Dremmel tool with circular file | Lowe's | Item # 525945 Model # 100-LG | |
| FUDR | Sigma | F0503 | |
| M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4) | Sigma | S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506 | |
| NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin) | BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest) | BD bioscience 211677, Lab Express 1001, Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | |
| Paraquat dichloride hydrate | Sigma | 36541 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | FSX100 |
Referencias
- C elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
- Herman, M. A. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , 1-16 (2006).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Chalfie, M., Hart, A. C., Rankin, C. H., Goodman, M. B. Assaying mechanosensation. WormBook. , (2014).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Deletion of the Mitochondrial Superoxide Dismutase sod-2 Extends Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5 (2), e1000361 (2009).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing Development. 132 (10), 519-521 (2011).
- Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 12 (2), 137-150 (1980).
- Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131 (5), 364-365 (2010).
- Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 133 (1), 46-49 (2012).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), e85964 (2014).
- Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Molecular Biology. 351, 275-286 (2006).
- Argon, Y., Ward, S. Caenorhabditis elegans fertilization-defective mutants with abnormal sperm. Genética. 96 (2), 413-433 (1980).
- Lee, S. J., Kenyon, C. Regulation of the longevity response to temperature by thermosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 19 (9), 715-722 (2009).
- Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mechanisms of Ageing Development. 6 (6), 413-429 (1977).
- Zhang, B., et al. Environmental Temperature Differentially Modulates C. elegans Longevity through a Thermosensitive TRP Channel. Cell Reports. 11 (9), 1414-1424 (2015).
- Michaelson, L. C. C. elegans: A Practical Approach. Ian A. Hope (ed.). Oxford University Press, Oxford. 1999. Pp. 281. ISBN 0 19 963738 5. Heredity. 85 (1), 97-100 (2000).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genética. 77 (1), 71-94 (1974).
- Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
- Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
- Henderson, S. T., Johnson, T. E. daf-16 integrates developmental and environmental inputs to mediate aging in the nematode Caenorhabditis elegans. Current Biology. 11 (24), 1975-1980 (2001).
- Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
- Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115 (4), 489-502 (2003).
- Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit. Methods. 68 (3), 476-486 (2014).
- Scerbak, C., Vayndorf, E. M., Hernandez, A., McGill, C., Taylor, B. E. Mechanosensory neuron aging: Differential trajectories with lifespan-extending alaskan berry and fungal treatments in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Aging Neuroscience. 8, 173 (2016).
- Vayndorf, E. M., et al. Morphological remodeling of C. elegans neurons during aging is modified by compromised protein homeostasis. npj Aging and Mechanisms of Disease. 2, 16001 (2016).
- Murakami, S., Johnson, T. E. A genetic pathway conferring life extension and resistance to UV stress in Caenorhabditis elegans. Genética. 143 (3), 1207-1218 (1996).
- Abbas, S., Wink, M. Green Tea Extract Induces the Resistance of Caenorhabditis elegans against Oxidative Stress. Antioxidants (Basel). 3 (1), 129-143 (2014).
- Yanase, S., Hartman, P. S., Ito, A., Ishii, N. Oxidative stress pretreatment increases the X-radiation resistance of the nematode Caenorhabditis elegans. Mutation Research. 426 (1), 31-39 (1999).
- Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
