Caenorhabditis Setaccio: Uno strumento low-tech e metodologia per l'ordinamento di piccoli organismi multicellulari
Summary
Il protocollo corrente include una metodologia per la cernita e la pulizia delle popolazioni di pari età di elegans di Caenorhabditis. Utilizza un semplice, poco costoso ed efficiente strumento su misura per ottenere una grande popolazione sperimentale dei nematodi per la ricerca.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un organismo di modello consolidata utilizzato in una gamma di ricerca biomedica di base. All’interno della comunità di ricerca del nematode, c’è un bisogno di un modo conveniente ed efficace per mantenere la popolazione di grande, di pari età di c. elegans. Qui, presentiamo una metodologia per meccanicamente l’ordinamento e la pulizia di c. elegans. Il nostro obiettivo è quello di fornire un processo conveniente, efficiente, veloce e semplice per ottenere animali di dimensioni uniformi e fasi della vita per il loro uso negli esperimenti. Questo strumento, il setaccio di Caenorhabditis , utilizza un sistema di coperchio su misura che discussioni sui tubi conici laboratorio comune e Ordina di c. elegans basato sulla dimensione del corpo. Inoltre dimostriamo che il setaccio di Caenorhabditis trasferisce efficacemente animali dalla piastra di una cultura ad un’altra che consente un ordinamento rapido, la sincronizzazione e pulizia senza impattare gli indicatori di salute, tra cui motilità e lo stress-viscoelastico reporter gene. Questo strumento innovativo e accessibile è un’opzione veloce, efficiente e non stressante per il mantenimento di popolazioni di c. elegans .
Introduction
Il verme nematode Caenorhabditis elegans, è un organismo modello premier. Oltre la natura semplice e controllata della loro coltivazione in laboratorio, è loro intero genoma sequenziato1 e il destino dello sviluppo di ogni cellula è noto2. Grazie a queste caratteristiche, c. elegans è un organismo di modello ampiamente usato per gli studi genetici. Tuttavia, insieme con queste caratteristiche benefiche vengono alcune sfide per i ricercatori. A causa del loro tempo di generazione rapida, popolazioni di c. elegans possono rapidamente a corto di cibo e/o diventano popolazioni con più generazioni miste e stadi di sviluppo presentano in una sola volta. Così, gli esperimenti eseguiti su supporti di solida crescita del nematode (NGM) richiedono ricercatori spostare fisicamente gli animali in piatti freschi prima esaurisce la fonte alimentare batterica e nuove larve si sviluppano. Questo può essere noioso come un frequente trasferimento degli animali è necessaria per prevenire le popolazioni sperimentali da diventando mescolato con generazioni di prole. Ancora, alcuni esperimenti richiedono entrambi i grandi numeri di animali e punti di tempo prolungato (ad es., estrazione di DNA o RNA in età adulta). Questo composti le sfide di accuratamente mantenendo una popolazione sincronizzata e il trasferimento di grandi quantità di animali.
Attuali metodi di trasferimento di c. elegans coltivati su NGM sono picking o lavare gli animali da piastra a piastra; trattare chimicamente gli animali (per esempio, con il DNA replica inibitore fluorodeossiuridina o FUDR); o mediante citometria a flusso per ordinare gli animali in piastre multi-pozzetto. Picking prevede l’utilizzo di uno strumento a mano, realizzato con un sottile filo di platino o un ciglio, trasferire manualmente i singoli o più animali3,4. Questo metodo è preciso ma richiede abilità e il tempo ed è una limitazione per gli studi che coinvolgono un numero elevato di animali. Picking maggio anche essere fisicamente dannosa e stressante per gli animali sottoponendo gli individui potenzialmente importi innaturali e incoerenti della dispersione e della forza. Lavaggio comporta una piastra di coltura con una soluzione tampone di risciacquo e trasferimento della soluzione con gli animali tramite vetro pipetta Pasteur di una nuova piastra di coltura. Questo metodo è rapido ed efficiente, ma non è accurato come più generazioni e stadi di sviluppo degli animali vengono trasferiti alla rinfusa. Trattamenti chimici, ad esempio FUDR, possono essere sciolto in coltura media per prevenire la produzione di prole attraverso il blocco di qualsiasi replica del DNA e quindi, lo sviluppo di uova e produzione di gameti. Mentre efficace, questo metodo deve essere applicato dopo la maturazione dello sviluppo per non interferire con i normali processi di sviluppo, e questo significa che c’è ancora un requisito per trasferire gli animali prima della sua amministrazione3. Questo metodo influisce anche più cellulari vie di segnalazione, con conseguente effetti notevoli sugli animali che invecchiano (ad esempio, un’estensione di durata della vita o un’alterata proteostasis) a seconda del ceppo di c. elegans utilizzato5, 6,7,8,9,10. Il flusso cytometry metodi automaticamente ordinare e trasferire singoli c. elegans da una piastra multi-pozzetto per un altro11. Mentre questo metodo è molto efficace ed efficiente, apparecchiatura di citometria a flusso è proibitivamente costosi e inaccessibili per molti ricercatori. Un’alternativa al trasferimento di animali consiste nell’utilizzare modelli di mutanti che sono termosensibili, quali fer-15 e fem-1, che diventano sterili con temperatura regolazione12. Durante l’utilizzo di animali mutanti è utile in alcune situazioni, questi ceppi specifici crescono più lentamente rispetto agli animali wild type e fanno affidamento su un genoma alterato, che serve come poveri rappresentanti per invecchiamento o sani vermi. Inoltre, il ricorso a un cambiamento di temperatura per indurre sterilità risultati anche in assenza di un ambiente statico, e cambiamenti di temperatura sono state prontamente indicati per influenzare gene espressioni13,14, 15. gruppi di ricerca sono pubblicati in precedenza tecniche che descrivono l’uso di una mesh per filtrare c. elegans di dimensioni16. Tuttavia, siamo riusciti a trovare un lavoro precedente test per eventuali modifiche negli esiti di salute globale che possono essere associati con l’uso di tali filtri.
C’è, così, un’esigenza di un metodo conveniente, efficiente, rapida e accurata per trasferire grandi quantità di animali tra piastre di coltura all’interno della comunità di ricerca di c. elegans . Abbiamo sviluppato un migliorato, accessibile pezzo di equipaggiamento (denominato il setaccio di Caenorhabditis ) e un protocollo associato per la fabbricazione e il suo funzionamento che soddisfa le esigenze della comunità di ricerca di c. elegans . Qui, condividiamo il design del setaccio di Caenorhabditis e metodi per il suo utilizzo, e dimostriamo che il suo utilizzo non influisce la salute comune o eventuali marcatori di stress rispetto alla raccolta manuale standard e un trattamento con il comunemente usati, limitare la fertilità chimica FUDR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nel presente documento, abbiamo introdotto la progettazione e l’uso del setaccio Caenorhabditis accessibile, efficace come strumento per l’ordinamento e il mantenimento di c. elegans. Questo strumento presenta diversi vantaggi per picking manualmente singoli animali, popolazioni, trattamenti chimici (ad esempio, FUDR) e metodi più costosi degli animali segregating di lavaggio. In primo luogo, il Caenorhabditis setaccio efficientemente e rapidamente (meno di 20 min) Ordina progenie da …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare Heather Currey per il suo contributo iniziale per lo studio di progettazione e Dr. Swarup Mitra per la sua revisione critica del manoscritto. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Michael B. Harris per commenti, perfezionamenti e assistenza nella produzione la dimostrazione di questa metodologia. I ceppi sono stati forniti dal centro Caenorhabditis genetica, che è finanziato dall’ufficio NIH di programmi di ricerca dell’infrastruttura (P40 OD010440). La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Institute Of General Medical Sciences del National Institutes of Health, sotto Premio numeri UL1GM118991, TL4GM118992 o RL5GM118990 e di un premio per lo sviluppo istituzionale (IDeA) da il National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health, sotto concessione numero 5P20GM103395-15. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. UA è un datore di lavoro AA/EO e istituzione educativa e vieta la discriminazione illegale contro qualsiasi individuo: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.
Materials
| Safety glasses | Uline | S-21076 | |
| Protective heat resistant glove | Grainger | Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 14-432-22 | |
| Synthetic Nylon mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd |
NTX20 and NTX50 | |
| Cyanoacrylate glue | Scotch Super Glue Liquid | SAD114 | |
| Pliers | Vampliers | VMPVT-001-8 | |
| Dremmel tool with circular file | Lowe's | Item # 525945 Model # 100-LG | |
| FUDR | Sigma | F0503 | |
| M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4) | Sigma | S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506 | |
| NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin) | BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest) | BD bioscience 211677, Lab Express 1001, Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | |
| Paraquat dichloride hydrate | Sigma | 36541 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | FSX100 |
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