線虫ふるい: ローテク装置と小型の多細胞生物の並べ替えのための方法論
Summary
現在のプロトコルを含むソートと年齢をマッチさせた集団のクリーニングの方法論線虫。それは研究用の線虫の実験的人口を取得するのに単純な安価なとカスタムメイドの効率的なツールを使用します。
Abstract
線虫(C. elegans) は基本的な生物医学の研究の範囲にわたって使用確立モデル生物です。線虫の研究コミュニティの中でc. の elegansの大規模な年齢をマッチさせた集団を維持する手頃な価格で効果的な方法の必要性があります。機械的に並べ替えと線虫のクリーニングの方法論を紹介します。私たちの目的は、均一サイズおよび実験での使用のためのライフ ステージの動物を取得するコスト効果の高い、効率的な高速、簡単なプロセスを提供することです。このツールは、線虫のふるいは、一般的な円錐ラボ チューブにスレッドし、線虫体サイズに基づいてを並べ替え特注蓋システムを使用してください。また線虫ふるい効果的にから転送する動物 1 つ培養プレート別急速な並べ替え、同期、および健康のマーカーに影響を与えることがなく洗浄できることを示す運動などストレス誘導性遺伝子記者。このアクセス可能な革新的なツールはc. の elegans個体群を維持するため高速で効率的、かつ非ストレスの多いオプションです。
Introduction
線虫、線虫はプレミア モデル生物です。研究室では、その栽培の簡単かつ制御された自然、に加えて彼らの全体のゲノムはシーケンス1と各細胞の発生運命は2知られています。これらの機能により線虫は遺伝学的研究のため広く使用されているモデル生物です。しかし、これらの有益な特性と一緒にには、研究者のいくつかの課題を来る。彼らの急速な生成の時間、 c. の elegans集団食品のうち実行することができますすぐにおよび/または複数の世代の集団を混合になって、発達段階を一度に提示します。したがって、固体線虫成長媒体 (NGM) の実験は研究者が細菌の食料源を使い果たすし、新しい幼虫を開発する前に、新鮮なプレートに動物を物理的に移動する必要。子孫世代と混ざらないから実験集団を防ぐために必要な動物の頻繁に転送するよう、これは退屈なことができます。それでも、いくつかの実験には、両方の多数の動物と長時間ポイント (例えば、成人期に DNA または RNA の抽出) が必要があります。これは正確に同期の人口を維持して、動物の数が多いを転送の課題を化合物します。
NGM 上で培養した線虫を転送する現在の方法は、ピッキングや洗濯の動物プレート;化学的に (例えば、DNA 複製阻害剤フルオロデオキシウリジンまたは FUDR); 動物の治療またはウェルプレートで動物を並べ替えるにフローサイトメトリーを使用して。ピッキングには、個人または複数の動物3,4を手動で転送する白金細線または、まつげで作られた手のひらツールの使用が含まれます。このメソッドの正確なが、スキルと時間が必要です、多数の動物の研究の制限。また 5 月を選ぶ可能性のある障害と力の不自然なと一貫性のない金額を個人をかけることによって物理的に有害な動物にストレスであります。洗濯と緩衝液の培養皿を洗浄し、新しい培養プレートにガラス パスツール ピペットで動物とソリューションを移すことを含みます。このメソッドでは複数の世代と動物の発達段階が一括で転送されるときに正確ではないが、迅速かつ効率的です。FUDR などの化学治療は、DNA 複製としたがって、配偶子の生産と卵の開発ブロックを介して子孫の生産を防ぐために養殖のメディアに溶解できます。しばらくの間効果的な正常発達プロセスを中断させないよう発達成熟後このメソッドを適用する必要があります、これはその管理3の前に動物を譲渡する必要がまだあることを意味します。このメソッドに複数携帯シグナル伝達経路、彼らの年齢として動物に顕著な影響の結果として (例えば、寿命延長または変更されたプロテオステイシス) c. の elegans使用5のひずみによっても影響します。 6,7,8,9,10。フローサイトメトリー メソッドは自動的に並べ替えし、別111 つのウェル プレートから個々 のc. の elegansを転送します。この方法は非常に効果的かつ効率的な流れの cytometry の機器は高価であり、多くの研究者がアクセスできません。動物を転送する代わりに、温度に敏感、 fer 15や有限要素法 1、温度調整12と無菌になるなど突然変異体のモデルを使用します。突然変異動物の使用はいくつかの状況で役に立つ、これらの特定の系統の野生型の動物よりも遅い成長、エージングや健康的なワームの貧しい人々 の代表者として、変化のゲノムに依存しています。また、不妊を引き起こす温度シフトへの依存はまた静的な環境の欠如の結果、遺伝子表現13,14,に影響を与える温度変化が容易に示されている15. 研究グループは以前のサイズ16 c. の elegansをフィルターするメッシュの使用を記述する技術を公開しています。しかし、このようなフィルターの使用と関連付けられるかもしれない全体的な健康の結果の変更テストの前の仕事を見つけることができませんでした。
こうして、線虫研究コミュニティ内で培養皿間動物の大きい数を転送するための手頃な価格、効率的、迅速、かつ正確な方法の必要性があります。(名前は線虫ふるい) 装置とその製造と線虫研究コミュニティのニーズを満たす操作の関連付けられているプロトコルの改良、アクセス可能な部分を開発しました。ここで、我々 は線虫ふるいとその使用方法の設計を共有し、一般的な健康または任意のストレス マーカー標準手動狩りと一般的使用、治療と比較した場合、その使用が影響しませんを紹介不妊治療を制限する化学 FUDR。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで、デザインと並べ替えと線虫を維持するためのツールとしてアクセス可能な効果的な線虫のふるいの使用を紹介しました。このツールには、手動で集団、化学処理 (例えばFUDR)、および分離動物のより高価な方法を洗濯、個々 の動物を狩りにいくつかの利点があります。まず、線虫ふるい効率的かつ迅速に (20 分以内) 動物 (表 2) の大規模な混合?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、研究デザインに彼女の初期の貢献のヘザー幣制と博士 Swarup ミトラ原稿の彼の批評のために感謝したいと思います。我々 はまた博士マイケル ・ b. ハリスありがとうコメント、改良、この方法論のデモの生産の支援したいと思います。系統は、線虫の遺伝学センター研究基盤プログラム (P40 OD010440) の NIH のオフィスによって資金が供給されるによって提供されました。この出版物で報告された研究がによって国立科学研究所の一般医療賞を受賞番号 UL1GM118991、TL4GM118992、または RL5GM118990 の下で健康の国民の協会のやから機関の開発賞 (アイデア) サポートされています。国立科学研究所の一般医療許可番号 5P20GM103395-15 の下で健康の国民の協会の。内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。UA は AA/EO の雇用者、教育機関、個人に対する違法な差別を禁止: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination。
Materials
| Safety glasses | Uline | S-21076 | |
| Protective heat resistant glove | Grainger | Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 14-432-22 | |
| Synthetic Nylon mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd |
NTX20 and NTX50 | |
| Cyanoacrylate glue | Scotch Super Glue Liquid | SAD114 | |
| Pliers | Vampliers | VMPVT-001-8 | |
| Dremmel tool with circular file | Lowe's | Item # 525945 Model # 100-LG | |
| FUDR | Sigma | F0503 | |
| M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4) | Sigma | S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506 | |
| NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin) | BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest) | BD bioscience 211677, Lab Express 1001, Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | |
| Paraquat dichloride hydrate | Sigma | 36541 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | FSX100 |
Referencias
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