جمع الحيوانات المنوية فرق الجودة باستخدام الكثافة المتدرجة الطرد المركزي
Summary
في هذه الورقة، ونحن نهدف إلى وصف أداء تقنية الطرد المركزي التدرج الكثافة وتطبيقه في بحوث فسيولوجيا الحيوانات المنوية.
Abstract
في التناسل الجنسي، الصمامات خلية الحيوانات المنوية أو مشيج الذكور مع مشيج أنثى لتحقيق الإخصاب. ومع ذلك، عدد كبير من الخلايا المنوية مع التسميد القدرة مطلوبة لتتفاعل مع مشيج الإناث لضمان الإخصاب. على هذا النحو، قدرة تخصيب الخلايا المنوية الفردية أمر حاسم لنجاح الاستنساخ. وقد استخدمت الكثافة المتدرجة الطرد المركزي لعدة عقود كأسلوب استنساخه، وسريعة، والكفاءة والفعالية والغاية قابلة للتكيف لجمع فقط جودة الحيوانات المنوية لاستخدامها في مساعدة التكنولوجيا الإنجابية. البروتوكولات ونحن المبينة في هذا التقرير تركز على استخدام أسلوب التدرج الطرد المركزي (بدجك) الكثافة بركل متقطع لعزل السكان ثلاثة متميزة من الحيوانات المنوية الديك بجودتها. كنا قادرين على جمع منخفضة ومتوسطة وعالية الجودة الحيوانات المنوية. كما يصف لنا استنساخه من البروتوكولات التي يترتب عليها تحديد إمكانات خصوبة الحيوانات المنوية بتقييم الجدوى والتنقل بينيترابيليتي. جمع الحيوانات المنوية بجودتها باستخدام تقنية بدجك سوف يكون من المفيد بدقة ودقة توصيف الحيوانات المنوية مع الخصوبة التفاضلية المحتملة.
Introduction
في الفقاريات، الأمشاج الذكور الخضوع لضغوط مكثفة انتقائية؛ ولذلك اللياقة البدنية التناسلية للذكور محوري لتحقيق نجاح الإخصاب. الذكور من أي الأنواع الفقارية معين يجب أن يكون قادراً على إنتاج خلايا الحيوانات المنوية بكميات كبيرة وذات نوعية كافية لتلبية احتياجات التسميد. خلايا الحيوانات المنوية، وقد رأس الحيوانات المنوية والسوط، هي الخلايا الأكثر استقطابا في الجسم. فأيضا متباينة للغاية في جودة الحيوانات المنوية (منخفضة حية وميتة شكلياً العادي وغير طبيعي وغير متحركة، متنقلة وعالية المتنقلة)، التي كشفت من خلال التفاوت الواسع في الكفاءة التناسلية للذكور. أكبر نسبة عالية الجودة من الحيوانات المنوية، أقل عدد ماتينجس المطلوبة لتسميد بنجاح البويضة. ومع ذلك، تحقيقا للخصوبة، خلايا الحيوانات المنوية العادية شكلياً الاعتماد على قوات دفعي تولدها سياط للوصول إلى الموقع للتسميد، وكذلك فيما يتعلق باختراق zona pellucida1 (ZP؛ وفي حالة الثدييات) أو بيريفيتيليني الداخلية الطبقة2 (إيبفل؛ وفي حالة الطيور والزواحف) للبويضة بعد التزاوج الطبيعي أو التلقيح الاصطناعي (منظمة العفو الدولية). تحديد الحيوانات المنوية الجودة اللازمة لاستخدامها في تقنيات الإنجاب المساعدة3 (الفن) وبرامج مختارة من تربية الذكور لاستخدامها في منظمة العفو الدولية4. من ناحية أخرى، يعتمد نجاح الفن فقط بناء على تقييم دقيق لنوعية الحيوانات المنوية. قد وضعت عددا من الاختبارات المعملية لتحديد الخصائص الوظيفية للحيوانات المنوية. المعلمات الأكثر أهمية هي مورفولوجية الحيوانات المنوية، الجدوى، التنقل، وتأهيلية (إنفلونزا الطيور في الحيوانات المنوية لا تتطلب تأهيلية5)، رد فعل أكروسومي (AR؛ والرقابة وإطلاق سراح إنزيم proteolytic من acrosome رأس الحيوانات المنوية)، والحيوانات المنوية اختراق ZP أو إيبفل، والتسميد6،،من78،9،،من1011. تدابير للخصوبة وحدها لا توفر تقييما دقيقا لقدرة صنع الأسمدة السكان الحيوانات المنوية11. تدابير للعديد من الأحداث المؤدية إلى إخصاب البويضة يسمح بتمثيل ملائم لأداء spermatocytes الفردية7.
المنهجية التي وضعت لقياس وظيفة الحيوانات المنوية يتم إبلاغها أساسا. على سبيل المثال، هي البقاء والتنقل وتغلغل إيبفل في إنفلونزا الطيور من الحيوانات المنوية، المعلمات الأكثر شيوعاً المستخدمة لتقييم الحيوانات المنوية نوعية8،،من1112. عدد الحيوانات المنوية حية في السائل المنوي يلعب دوراً حاسما لبقاء الحيوانات المنوية نظراً لوجود عدد كبير من الحيوانات المنوية ميتة في السائل المنوي يؤثر على نوعية الحيوانات المنوية. وهذا يعزز إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في السائل المنوي ويسبب الضرر التأكسدي ل الحيوانات المنوية الحية13. تنقل الحيوانات المنوية، القدرة على الحركة فلاجلر الطيور الحيوانات المنوية ضد المقاومة في درجة حرارة الجسم، من المعروف أن تلعب دوراً مباشرا في أحداث الإخصاب8. كذلك ثبت أن الحراك يرتبط ارتباطاً إيجابيا بالخصوبة، وهي لذلك، أحد المحددات أساسية للخصوبة8. ومع ذلك، كما يجب الحيوانات المنوية متحركة القدرة على الخضوع AR واختراق إيبفل11. إيبفل فحوصات الاختراق تأخذ في الاعتبار لكل الحيوانات المنوية التي تشارك في عملية التسميد11.
في تطبيق الفن، عادة ما تتم معالجة السائل المنوي بغية تحقيق أقصى قدر من تركيز الحيوانات المنوية عالية الجودة وتقليل تركيز الحيوانات المنوية منخفضة الجودة. وبعد جمع السائل المنوي ويمكن إثراء نسبة الحيوانات المنوية عالية الجودة من خلال إجراءات فصل الحيوانات المنوية شيوعاً في ممارسات الصناعة والبحوث. العديد من هذه الإجراءات وضعت، مع جميع المزايا الخاصة بكل منها والقيود، ولكن الجميع الاستفادة من الطابع غير المتجانس للحيوانات المنوية لجمع الحيوانات المنوية فقط مع القدرة على صنع الأسمدة عالية. وتشمل هذه الإجراءات طرق هجرة الحيوانات المنوية، وتمسك العمود الترشيح وكثافة التدرج الطرد المركزي (DGC)14،15،16،18،،من1719 , 20-من بين التقنيات المتاحة، تم العثور على DGC أن تكون بسيطة جداً، وقابلة للتكرار، وفعالة من حيث التكلفة والكفاءة في عزل أقصى قدر ممكن من الحيوانات المنوية عالية الجودة للاستخدام في الفن مع الهدف المتمثل في تعظيم فرصة الإخصاب14 , 15-وبالإضافة إلى ذلك، DGC لا تضر بغشاء الخلية المنوية. وفي المقابل، طرق هجرة الحيوانات المنوية جمع الحيوانات المنوية إلا تدريجيا الجوال18،19، ولكن كمية الحيوانات المنوية التي جمعت منخفضة جداً، مما يجعلها غير فعالة في جمع كميات كبيرة من الحيوانات المنوية18، 20-تمسك العمود الترشيح فعالة جداً في تصفية الكثيري الحيوانات المنوية من السائل المنوي17؛ ومع ذلك، فإنه يميل إلى أن يكون تضر بالحيوانات المنوية الأغشية20،21.
في الأسلوب DGC، هو الركيزة الأكثر استخداماً لتوليد التدرج الكثافة بركل، التي تتألف من جزيئات السليكا الغروية المغلفة في بوليفينيلبريروليدوني. بركل الكثافة المتدرجة الطرد المركزي (بدجك) يمكن أن يكون أما مستمر أو متقطع ولكن تدرج الانقطاع هو الأكثر استخداماً لعزل عالية الغلة من الحيوانات المنوية الكثيري13،،من1620. في تدرج متقطع، أقل كثافة وسائل الإعلام يعوم فوق أعلى كثافة الإعلام، إنشاء تدرج الذي يزيد في الكثافة من الأعلى إلى أسفل أنبوب مخروطي. يؤدي هذا إلى إنشاء حدود في مجال التفاعل بين وسائط الإعلام اثنين من كثافة مختلفة. كفاءة بدجك مشتق من عاملين هما: 1) دفعي قدرة الحيوانات المنوية خلايا فردية و 2) ميل الخلايا المنوية مع السلامة الهيكلية عالية يكون زيادة كثافة. أفضل الحيوانات المنوية مع التنقل أعلى قادرة على عبور من انخفاض كثافة وسائل الإعلام وتخترق أعلى كثافة وسائل الإعلام. انخفاض الحيوانات المنوية التنقل من المرجح أن تصبح المحاصرين في الحدود تم إنشاؤها بواسطة التفاعل بين وسائط الإعلام المختلفة ذات الكثافة. الخلايا المنوية مع السلامة الهيكلية عالية والحراك تميل إلى أن تكون أعلى كثافة من خلايا الحيوانات المنوية متحركة ميتة أو غير طبيعي أو منخفض. عندما يتم تطبيق قوة الطرد المركزي في بدجك، وهذا يسهل حركة الحيوانات المنوية بكثافات مختلفة إلى مكان كل منهما في التدرج.
في الممارسة العامة، بعد إجراء بدجك، يتم جمع بيليه لينة للحيوانات المنوية مع الخصوبة المرتفعة المحتملة في الجزء السفلي من الأنبوبة المخروطية، ويتم تجاهل الباقي. ومع ذلك، ميزة غير مستغلة من هذا الأسلوب هو قدرته على فصل الخلايا المنوية إلى عدة مجموعات استناداً إلى الاختلافات النوعية. لأغراض البحث، يتيح فصل الحيوانات المنوية بدرجة جودة استخدام تقنية بدجك لدراسة نوعية الحيوانات المنوية أنها تتعلق بالاختلافات الفسيولوجية، metabolomic والبروتين. هنا، نحن نهدف إلى بالتفصيل كيف يمكن استخدام هذا الأسلوب فصل الحيوانات المنوية بالجودة، فضلا عن إثبات هذه الاختلافات في الجودة، باستخدام nigrosin ويوزين المحددة سابقا تلطيخ حيوية للبقاء، الإنزيم أككودينز للتنقل، والحيوانات المنوية-إيبفل تحليل التفاعل بينيترابيليتي.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخصوبة ليس فقط يحدد ربحية الإنتاج الحيواني ولكن أيضا بمثابة وسيلة للانتقاء الطبيعي للأنواع للوجود. الوظيفة في نهاية المطاف من خلية الحيوانات المنوية لتخصيب البويضة. تحديد قناة للإناث فقط تلك الحيوانات المنوية الأصلح ضمانا لاخصاب البويضة23،24. وأظهرت الدر?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
لا شيء.
Materials
| Accudenz | Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA | AN7050 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | P7828 | |
| Schiff’s reagent | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | 3952016 | |
| TES | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | T1375 | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | E4009 | |
| Nigrosin | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | 198285 | |
| ST 40R Centrifuge | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 75004524 | |
| DU 530 Life Sciences UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter, Brea, CA, USA | No catalogue is found | |
| Olympus IX 71 Inverted Fluorescence and Phase Contrast Microscope | Olympus America Inc., PA, USA | No catalogue is found |
Referencias
- Spargo, S. C., Hope, R. M. Evolution and nomenclature of the zona pellucida gene family. Biology Reproduction. 68, 358-362 (2003).
- Okamura, F., Nishiyama, H. The passage of spermatozoa through the vitelline membrane in the domestic fowl, Gallus gallus. Cell and Tissue Research. 188 (3), 497-508 (1978).
- Henkel, R., et al. Sperm function and assisted reproduction technology. Reproductive Medicine and Biology. 4, 7-30 (2005).
- Reddy, R. P., Bakst, M. R., Wishart, G. J. Artificial Insemination of broilers: Economic and management implications. Proceedings of 1st International Symposium on Artificial Insemination of Poultry. Poultry Science Association. , 73-89 (1995).
- Howarth, B. An Examination for Sperm Capacitation in the Fowl. Biology of Reproduction. 3, 338-341 (1971).
- Menkveld, R., Holleboom, C. A. G., Rhemrev, J. P. T. Measurement and significance of sperm morphology. Asian Journal of Andrology. 13, 59-68 (2011).
- Kumaresan, A., Johannisson, A., Al-Essawe, E. M., Morrell, J. M. Sperm viability, reactive oxygen species, and DNA fragmentation index combined can discriminate between above- and below-average fertility bulls. Journal of Dairy Science. 100, 5824-5836 (2017).
- Froman, D. P., McLean, D. J. Objective measurement of sperm motility based upon sperm penetration of Accudenz. Poultry Science. 75, 776-784 (1996).
- Zaneveld, L. J., De Jonge, C. J., Anderson, R. A., Mack, S. R. Human sperm capacitation and the acrosome reaction. Human Reproduction. 6 (9), 1265-1274 (1991).
- Ahammad, M. U., et al. Acrosome reaction of fowl sperm: Evidence for shedding of acrosomal cap in intact form to release acrosomal enzyme. Poultry Science. 92 (3), 798-803 (2013).
- Ahammad, M. U., et al. Maturational changes in motility, acrosomal proteolytic activity, and penetrability of the inner perivitelline layer of fowl sperm, during their passage through the male genital tract. Theriogenology. 76 (6), 1100-1109 (2011).
- Chalah, T., Brillard, J. P. Comparison of assessment of fowl sperm viability by eosin-nigrosin and dual fluorescence. Theriogenology. 50 (3), 487-493 (1998).
- Aitken, R. J., West, K. M. Analysis of the relationship between reactive oxygen species production and leukocyte infiltration in fractions of human semen separated on Percoll gradients. International Journal of Andrology. 13, 433-451 (1990).
- Mortimer, D., Mortimer, S. T., Carrell, D., Aston, K. Density Gradient Separation of Sperm for Artificial Insemination. Spermatogenesis. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols. , 927 (2013).
- Qingling, Y., et al. Processing of semen by density gradient centrifugation selects spermatozoa with longer telomeres for assisted reproduction techniques. Reproductive BioMedicine Online. 31, 44-50 (2015).
- Moohan, J. M., Lindsay, K. S. Spermatozoa selected by a discontinuous Percoll density gradient exhibit better motion characteristics, more hyperactivation, and longer survival than direct swim-up. Fertility and Sterility. 64 (1), 160-165 (1995).
- Paulson, J. D., Polakoski, K. L. A glass wool column procedure for removing extraneous material from human ejaculate. Fertility and Sterility. 28, 178-181 (1977).
- Ahammad, M. U., Chiaki, N., Tatemoto, H., Kawamoto, Y., Nakada, T. Utilization of the swim-up migration sedimentation technique to separate viable and progressively motile fowl spermatozoa. World’s Poultry Science Association Proceedings. , (2010).
- Lucena, E., et al. Recovery of motile sperm using the migration-sedimentation technique in an in vitro fertilization-embryo transfer programme. Human Reproduction. 4 (2), 163-165 (1989).
- Henkel, R. Sperm Processing for IVF. Clinical Embryology: A Practical Guide. , (2013).
- Sherman, J., Paulson, D., Liu, K. Effect of glass wool filtration on ultrastructure of human spermatozoa. Fertility and Sterility. 36, 643-647 (1981).
- Freund, M., Carol, B. Factors affecting haemocytometer counts of sperm concentration in human semen. Journal of Reproduction and Fertility. 8, 149-155 (1964).
- Bakst, M. R., Wishart, G. J., Brillard, J. P. Oviducal sperm selection, transport and storage in poultry. Poultry Science Review. 5, 117-143 (1994).
- Ahammad, M. U., Okamoto, S., Kawamoto, Y., Nakada, T. The effects of regular fluid secretion from the uterus of laying hens on the longevity and fertilization ability of fowl sperm in the oviduct. Poultry Science Journal. 1 (1), 13-22 (2013).
- Ahammad, M. U., et al. Maturational changes in the survivability and fertility of fowl sperm during their passage through the male reproductive tract. Animal Reproduction Science. 128 (1-4), 129-136 (2011).
- Choi, K. H., Emery, D. A., Straub, D. E., Lee, C. S. Percoll process can improve semen quality and fertility in turkey breeders. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 12 (5), 702-707 (1999).
- Chen, M. J., Bongso, A. Comparative evaluation of two density gradient preparations for sperm separation for medically assisted conception. Human Reproduction. 14 (3), 759-764 (1999).
