Recogida de esperma de calidad diferencial mediante centrifugación de gradiente de densidad
Summary
En este trabajo, nuestro objetivo es describir el funcionamiento de la técnica de centrifugación del gradiente de densidad y su aplicación en la investigación de fisiología de la esperma.
Abstract
En reproducción sexual, un gameto masculino o espermatozoide se fusiona con un gameto femenino para lograr la fertilización. Sin embargo, un gran número de espermatozoides con capacidad de fertilización está obligado a interactuar con un gameto femenino para fertilización. Como tal, la capacidad fecundante de los espermatozoides individuales es fundamental para la reproducción acertada. Centrifugación de gradiente de densidad se ha utilizado durante décadas como un método reproducible, rápido, eficiente, eficaz y extremadamente adaptable para recoger sólo alta calidad esperma para ser utilizado en reproducción asistida. Los protocolos que hemos descrito en este documento se centran en la utilización de la técnica de gradiente de centrifugación (PDGC) de densidad discontinua de Percoll para aislar a tres poblaciones distintas de la esperma de gallo por su calidad. Hemos podido recoger espermatozoides de calidad, medio y bajo. También describimos protocolos reproducibles que implican determinación potencial de fertilidad de los espermatozoides mediante la evaluación de su viabilidad, movilidad y penetración. Colección de esperma por su calidad técnica PDGC sería útil con precisión y caracterizar bien esperma con diferencial fertilidad potencial.
Introduction
En los vertebrados, gametos masculinos someterse a intensa presión selectiva; por lo tanto la aptitud reproductiva de un hombre es fundamental para lograr la fertilización exitosa. Los machos de cualquier especie vertebrado dado deben ser capaces de producir espermatozoides en grandes cantidades y calidad suficiente para satisfacer las necesidades de fertilización. Células de la esperma, con una cabeza del espermatozoide y un flagelo, son las células más polarizadas en el cuerpo. También son muy heterogéneos en la calidad de los espermatozoides (vivo y muerto, morfológicamente normal y anormal e inmóvil, poco móvil y alta móvil), que se revela a través de la amplia variación en la eficiencia reproductiva de los machos. Cuanto mayor sea la proporción de espermatozoides de alta calidad, menos el número de apareamientos requerido con éxito fertilizar el óvulo. Sin embargo, para lograr la fertilidad, las células de espermatozoides morfológicamente normales dependen de propulsiva fuerzas generadas por sus flagelos al llegar al sitio de fertilización, así como para penetrar la zona pelúcida1 (ZP; en el caso de mamíferos) o perivitelino interior Layer2 (IPVL; en el caso de aves y reptiles) del óvulo después de la monta natural o inseminación artificial (IA). Determinación de esperma calidad es necesaria para el uso de tecnologías de reproducción asistida3 (arte) y selección de machos reproductores en AI programas4. Por otra parte, el éxito del arte únicamente depende de la precisa evaluación de la calidad del esperma. Ha desarrollado una serie de pruebas de laboratorio para determinar las características funcionales de los espermatozoides. Los parámetros más importantes son la morfología espermática, movilidad, viabilidad, capacitación (esperma aviar no requieren capacitación5), reacción acrosómica (AR; exocitosis y la liberación de una enzima proteolítica del acrosoma de la cabeza del espermatozoide), esperma penetración de la ZP o IPVL y fertilización6,7,8,9,10,11. Medidas de la fecundidad solo no proporcionan una evaluación exacta de la capacidad fecundante de espermatozoides población11. Medidas de los varios eventos previos a la fertilización de un óvulo permiten una representación adecuada del rendimiento de espermatocitos individual7.
La metodología desarrollada para la medición de función de la esperma es principalmente propios de cada especie. Por ejemplo, en los espermatozoides aviares, viabilidad, movilidad y penetración de la IPVL son los parámetros más comunes utilizados para evaluar la calidad de esperma8,11,12. El número de espermatozoides vivos en el eyaculado desempeña un papel crucial para la supervivencia de los espermatozoides debido a la presencia de un gran número de espermatozoides muertos en el eyaculado afecta la calidad de los espermatozoides. Esto aumenta la producción de especies reactivas de oxígeno en el semen y produce daño oxidativo en el esperma vivo13. Movilidad de espermatozoides, la capacidad de movimiento flagelar de los espermatozoides aviares contra la resistencia a la temperatura corporal, es conocido por desempeñar un papel directo en el fertilización8. Está bien establecido que la movilidad se correlaciona positivamente con la fertilidad y es, por tanto, un determinante principal de fertilidad8. Sin embargo, un espermatozoide móvil también debe tener la capacidad de someterse a una AR y penetrar la IPVL11. Ensayos de penetración IPVL tengan en cuenta para cada esperma que participa en el proceso de fertilización11.
En la aplicación del arte, eyaculado generalmente se procesa con el fin de maximizar la concentración de espermatozoides de alta calidad y minimizar la concentración de espermatozoides de baja calidad. Después de la recolección de semen, la proporción de espermatozoides de alta calidad puede ser enriquecida a través de procedimientos de separación de espermatozoides utilizados en las prácticas de la industria y la investigación. Muchos de estos procedimientos se han desarrollado, con respectivas ventajas y limitaciones, pero todos utilizan la naturaleza heterogénea de recoger sólo los espermatozoides con alta capacidad fecundante de los espermatozoides. Estos procedimientos incluyen métodos de migración espermática, filtración de la columna de adherencia y densidad gradiente de centrifugación (DGC)14,15,16,17,18,19 , 20. entre las técnicas disponibles, la DGC se ha encontrado para ser muy sencilla, repetible, rentable y eficiente en el aislamiento de la mayor cantidad de esperma de alta calidad para uso en el arte con el objetivo de maximizar la probabilidad de fertilización14 , 15. Además, DGC no es perjudicial para la membrana de la célula de la esperma. En contraste, métodos de migración de esperma recogen espermatozoides sólo progresivamente móviles18,19, pero la cantidad de semen recogido es muy baja, lo que es ineficiente en la recolección de grandes volúmenes de esperma18, 20. filtración de columna de adherencia es muy eficiente en filtrado altamente móvil de la esperma del semen17; sin embargo, tiende a ser perjudicial para las membranas de espermatozoides20,21.
En la técnica de la DGC, el sustrato más utilizado para generar el gradiente de densidad es Percoll, que consiste en partículas de sílice coloidal cubiertas en polyvinylpryrolidone. Centrifugación gradiente de densidad de Percoll (PDGC) puede ser continua o discontinua pero un gradiente discontinuado es más comúnmente utilizado para alto rendimiento de aislamiento de espermatozoides móviles altamente13,16,20. En un gradiente discontinuo, bajo medios de densidad flotan en la superficie mayor densidad los medios de comunicación, crea un gradiente que aumenta en densidad de la parte superior a la parte inferior de un tubo cónico. Esto crea límites en la interfaz entre dos medios de diferente densidad. La eficacia de PDGC se deriva de dos factores: 1) la capacidad propulsora de espermatozoides individuales y 2) la tendencia de espermatozoides con alta integridad estructural a tener una mayor densidad. Espermatozoides con mayor movilidad son más capaces de cruzar de media densidad inferior y penetrar en un medio de densidad más alta. Espermatozoides de movilidad inferiores son más propensos a quedar atrapados en los límites creados por la interfaz entre medios de diferente densidad. Espermatozoides con movilidad y alta integridad estructural tienden a tener una densidad mayor muertos, anormales o bajos espermatozoides móviles. Cuando se aplica la fuerza centrífuga en PDGC, esto facilita el movimiento del esperma con densidades diferentes a su lugar respectivo en el gradiente.
En la práctica general, después de realizar la PDGC, se recoge el sedimento suave de espermatozoides con alta fertilidad potencial en la parte inferior del tubo cónico, y el resto se descarta. Sin embargo, una ventaja subutilizada de esta técnica es su capacidad para separar las células espermáticas en varios grupos basados en las diferencias de calidad. Para fines de investigación, separación de espermatozoides por grado de calidad utilizando la técnica PDGC permite el estudio de la calidad del esperma lo que respecta a las diferencias fisiológicas, de metabolómica y proteómica. Aquí, nuestro objetivo es detallar cómo puede utilizarse esta técnica para separar los espermatozoides por calidad, como demuestran estas diferencias en la calidad, utilizando previamente establecidas de eosina-nigrosina tinción vital para la viabilidad, análisis de Accudenz movilidad esperma IPVL Análisis de interacción para la penetración.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fertilidad no sólo determina la rentabilidad de la producción animal, sino que también actúa como un medio de selección natural de especies de existencia. Es de la última función de una célula de la esperma fertilizar un óvulo. El oviducto de una hembra selecciona sólo los espermatozoides más aptos para asegurar la fertilización del óvulo23,24. In vitro los estudios también han revelado una estrecha correlación entre rasgos cualitativos es…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ninguno.
Materials
| Accudenz | Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA | AN7050 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | P7828 | |
| Schiff’s reagent | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | 3952016 | |
| TES | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | T1375 | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | E4009 | |
| Nigrosin | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | 198285 | |
| ST 40R Centrifuge | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 75004524 | |
| DU 530 Life Sciences UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter, Brea, CA, USA | No catalogue is found | |
| Olympus IX 71 Inverted Fluorescence and Phase Contrast Microscope | Olympus America Inc., PA, USA | No catalogue is found |
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