Coleção de esperma de qualidade diferencial usando centrifugação gradiente de densidade

Summary

Neste trabalho, pretendemos descrever o desempenho da técnica de centrifugação gradiente de densidade e sua aplicação na investigação de fisiologia de esperma.

Abstract

Na reprodução sexuada, um gameta masculino ou espermatozoide funde-se com um gameta feminino para trazer sobre fertilização. No entanto, um grande número de espermatozoides com capacidade de fertilização é necessárias para interagir com um gameta feminino para garantir a fecundação. Como tal, a capacidade de fertilização dos espermatozoides individuais é fundamental para a reprodução bem sucedida. Centrifugação de gradiente de densidade tem sido utilizada por várias décadas como um método reprodutível, rápido, eficiente, eficaz e extremamente adaptável para recolher o esperma, só alta qualidade para ser usado em tecnologia de reprodução assistida. Os protocolos que descrevemos aqui centrar-se na utilização da técnica de centrifugação gradiente (PDGC) de densidade Percoll descontínua para isolar três populações distintas de esperma do galo por sua qualidade. Fomos capazes de coletar baixo, médio e alta qualidade esperma. Descrevemos também protocolos reprodutíveis que impliquem determinante potencial de fertilidade do esperma, avaliando sua viabilidade, a mobilidade e a penetração. Coleta de esperma por sua qualidade técnica PDGC seria útil com precisão e caracterizar completamente esperma com fertilidade diferencial potencial.

Introduction

Nos vertebrados, gametas masculinos passam por intensa pressão seletiva; Portanto a aptidão reprodutiva de um macho é crucial para alcançar a fecundação bem sucedida. Os machos de qualquer espécie de vertebrados determinado devem ser capazes de produzir espermatozoides em grandes quantidades e de qualidade suficiente para satisfazer as necessidades de fertilização. As células de esperma, para ter uma cabeça de esperma e um flagelo, são as células mais polarizadas no corpo. Eles também são muito heterogêneos na qualidade do esperma (ao vivo e morta, morfologicamente normal e anormal e imóvel, baixa, alta e móvel móvel), que é revelada através da ampla variação na eficiência reprodutiva dos machos. Quanto maior a proporção de espermatozoides de alta qualidade, o menos o número de acasalamentos necessários para com êxito fertilizar o óvulo. No entanto, para alcançar a fertilidade, espermatozoides morfologicamente normais dependem propulsiva forças geradas pelos seus flagelos para chegar ao local da fertilização, bem como para penetrar a zona pelúcida¹ (ZP; no caso dos mamíferos) ou perivitelline interna camada² (IPVL; no caso de aves e répteis) o óvulo após o acasalamento natural ou inseminação artificial (AI). Determinação de esperma qualidade é necessária para uso em técnicas de reprodução assistida³ (arte) e⁴programas de seleção de machos reprodutores para ser usado no AI. Por outro lado, o sucesso da arte depende unicamente a avaliação precisa da qualidade do esperma. Um número de testes de laboratório foram desenvolvido para determinar as características funcionais de esperma. Os parâmetros mais importantes são a morfologia do esperma, a viabilidade, a mobilidade, a capacitação (aviária esperma não exigem capacitação⁵), reacção acrossómica (AR; exocitose e liberação de uma enzima proteolítica de acrossoma da cabeça do espermatozoide), esperma penetração de ZP ou IPVL e fertilização^{6,7,8,9,10,11}. Medidas de fertilidade sozinha não fornecem uma avaliação exata da capacidade fertilização de um esperma população¹¹. As medidas dos vários eventos que antecederam a fecundação de um óvulo permitem uma representação adequada do desempenho de espermatócitos individuais⁷.

A metodologia desenvolvida para medir a função do esperma é principalmente espécie-específicos. Por exemplo, no esperma, aviária, viabilidade, a mobilidade e a penetração de IPVL são os parâmetros mais comuns utilizados para avaliar a qualidade de esperma a^8,11,12. O número de esperma vivo na ejaculação desempenha um papel crucial para a sobrevivência do esperma, porque a presença de um grande número de esperma morto no sêmen afeta a qualidade do esperma. Isto aumenta a produção de espécies reactivas de oxigénio no sêmen e causa dano oxidativo para o esperma vivo¹³. Mobilidade do esperma, a capacidade para o movimento flagelar de esperma aviária contra resistência a temperatura do corpo, é conhecida por desempenhar um papel direto em trazer sobre fertilização⁸. Está bem estabelecido que a mobilidade é positivamente correlacionada com a fertilidade e é, portanto, um determinante primário da fertilidade⁸. No entanto, um espermatozoide móvel também deve ter a capacidade de se submeter a um AR e penetrar o IPVL¹¹. Ensaios de penetração de IPVL tem em conta para todo o esperma que participa no processo de fertilização¹¹.

Na aplicação da arte, ejaculação é normalmente processada a fim de maximizar a concentração de espermatozoides de alta qualidade e minimizar a concentração de espermatozoides de baixa qualidade. Após a colheita de sémen, a proporção de espermatozoides de alta qualidade pode ser enriquecida através de procedimentos de separação de espermatozoides comumente usados em práticas tanto a indústria e a investigação. Muitos desses procedimentos têm sido desenvolvidos, todos com os respectivos benefícios e limitações, mas todos utilizam a heterogeneidade de esperma para coletar apenas o esperma com alta capacidade de fertilização. Estes procedimentos incluem métodos de migração de esperma, filtragem de coluna de aderência e densidade gradiente centrifugação (DGC)^{14,15,16,17,18,19 , 20}. entre as técnicas disponíveis, DGC foi encontrada para ser muito simples, repetível, rentável e eficiente no isolamento do montante máximo de espermatozoides de alta qualidade para uso na arte com o objetivo de maximizar a chance de fertilização^{14 , 15}. Além disso, a DGC não é prejudicial para a membrana da célula de esperma. Em contraste, métodos de migração de esperma coletar esperma só progressivamente móvel^18,19, mas a quantidade de esperma coletada é muito baixa, tornando-se ineficiente coleta de grandes volumes de esperma^{18, 20}. filtragem de coluna de aderência é muito eficiente na filtragem de espermatozoides altamente móveis de sémen¹⁷; no entanto, tende a ser prejudicial ao esperma membranas^20,21.

A técnica da DGC, o substrato mais comumente usado para gerar o gradiente de densidade é Percoll, que consiste de partículas de sílica coloidal, revestidas em polyvinylpryrolidone. Percoll centrifugação gradiente de densidade (PDGC) pode ser contínua ou descontínua, mas um gradiente descontínuo é mais comumente usado para isolamento de alto rendimento de espermatozoides altamente móveis^13,16,20. Em um gradiente descontínuo, mídia de densidade inferior flutua sobre mídia de densidade mais elevada, criando um gradiente que aumenta a densidade do topo para o fundo de um tubo cônico. Isso cria limites na interface entre os dois meios de densidade diferente. A eficiência de PDGC é derivada de dois fatores: 1) a capacidade de propulsão dos espermatozoides individuais e 2) a tendência dos espermatozoides com alta integridade estrutural para ter um aumento da densidade. Esperma com maior mobilidade é mais capazes de atravessar de mídia de densidade mais baixa e penetrar em uma mídia de densidade mais elevada. Baixa mobilidade de espermatozoides é mais propensos a ficar presas no limite do criado pela interface entre meios de densidade diferente. Espermatozoides com alta integridade estrutural e mobilidade tendem a ter uma maior densidade do que morto, anormais ou baixas espermatozoides móveis. Quando a força centrífuga é aplicada em PDGC, isto facilita a movimentação dos espermatozoides com diferentes densidades para seus respectivos lugares no gradiente.

Na prática geral, depois PDGC é executada, a pelota macia de esperma com alta fertilidade potencial na parte inferior do tubo cónico é coletada, e o restante é Descartado. No entanto, uma vantagem desta técnica subutilizada é sua capacidade de separar as células de esperma em vários grupos, com base nas diferenças de qualidade. Para fins de pesquisa, separação de espermatozoides pelo grau de qualidade, utilizando a técnica PDGC permite para estudo da qualidade do esperma no que tange a fisiológica, metabolómica e proteomic diferenças. Aqui, pretendemos detalhar como esta técnica pode ser usada para separar o esperma pela qualidade, bem como demonstrar estas diferenças de qualidade, utilizando a coloração vital nigrosin-eosina estabelecida anteriormente para viabilidade, ensaio de Accudenz para mobilidade e esperma-IPVL ensaio de interação para penetração.

Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade da Geórgia e institucional Cuidado Animal. 1. lavar usando centrifugação tradicional Prepare a solução de tampão fosfato (PBS). Adicione 8,0 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4 e 0,24 g de KH2PO4 a 800 mL de água destilada (dH2O). Ajustar o pH para 7,4 usando 0.1 N HCl e trazer a solução para 1 L com dH2O. …

Representative Results

A técnica PDGC resultou na separação distinta de três camadas de esperma pelo grau de qualidade em todos os parâmetros. Separa o esperma em uma camada de alta qualidade abaixo a solução de densidade mais elevada, uma camada de qualidade média entre o maior e solução de densidade menor e uma camada de baixa qualidade acima a solução de menor densidade. Estas diferenças de qualidade são evidenciadas diferenças claras de viabilidade (Figura 4), mo…

Discussion

Fertilidade não só determina a rentabilidade da produção animal, mas também atua como um meio de seleção natural das espécies para a existência. A função final de uma célula de esperma é fertilizar um óvulo. O oviduto de uma fêmea seleciona somente as mais aptas esperma para garantir a fertilização do óvulo^23,24. Estudos in vitro também revelaram uma estreita correlação entre características qualitativas esperma e fertilização suc…

Materials

Accudenz	Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA	AN7050
Percoll	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	P7828
Schiff’s reagent	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	3952016
TES	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	T1375
Eosin Y	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	E4009
Nigrosin	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	198285
ST 40R Centrifuge	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	75004524
DU 530 Life Sciences UV/Vis Spectrophotometer	Beckman Coulter, Brea, CA, USA		No catalogue is found
Olympus IX 71 Inverted Fluorescence and Phase Contrast Microscope	Olympus America Inc., PA, USA		No catalogue is found