Rab10リン酸化を評価してパーキンソン病関連LRRK2キナーゼ経路を尋問するためのヒト末梢血好中球分離
Summary
ロイシンの変異は、リピートキナーゼ2遺伝子(LRRK2)が遺伝性パーキンソン病を引き起こす。我々はヒト末梢血中のRab10のLRRK2制御リン酸化を評価するための容易で、強い方法を開発した。これは、LRRK2キナーゼ経路活性の増加を有する個体を同定するのに役立つ可能性がある。
Abstract
ロイシンリッチリピートキナーゼ2(LRRK2)は、遺伝性パーキンソン病(PD)における最も頻繁に変異した遺伝子であり、すべての病原性LRRK2突然変異はキナーゼ機能の過剰活性化をもたらす。ここでは、ヒト末梢血中のLRRK2キナーゼ経路活性を定量化するための容易で強いアッセイを、その生理学的基質の1つであるRab10のLRRK2制御リン酸化をスレオニン73で測定することによって説明する。記載された免疫ブロット法は、MJFF-pRab10ウサギモノクローナル抗体のようなLRRK2によってリン酸化されたRab10 Thr73エピトープを認識する完全に選択的かつホスホウオンギクオン性抗体を必要とする。末梢血は容易にアクセス可能であり、好中球は豊富で均質な構成成分であるため、ヒト末梢血好中球を使用する。重要なことに、好中球はLRRK2とRab10の両方の比較的高いレベルを発現する。好中球の潜在的な欠点は、その高い固有のセリンプロテアーゼ活性であり、これは、溶菌緩衝液の一部として有機リンニューロトキシンジイソプロピルフルオロリン酸塩(DIFP)のような非常に強力なプロテアーゼ阻害剤の使用を必要とする。それにもかかわらず、好中球は、生体内のLRRK2キナーゼ経路活性の研究のための貴重なリソースであり、PDバイオレポジトリコレクションに含まれるように考慮されるべきである。
Introduction
パーキンソン病(PD)を遅くまたは停止する試みは、これまでのところ失敗しています。PDのリスクを引き起こすおよび/または増加するロイシンリッチリピートキナーゼ2(LRRK2)における過剰活性化突然変異の発見は、LRRK2キナーゼ阻害剤11、2、32,3の開発につながっている。これらは今臨床試験4に入りました。LRRK2の正確な機能は不明であるが、大きな進歩は、LRRK2キナーゼ5、6、7,6,7の最初のボナフィデス生理基質としてRab10を含むRab GTPaseタンパク質のサブセットの同定であった。疾患修飾治療の時代における主な課題は、LRRK2キナーゼ活性化状態の生化学的マーカーおよびLRRK2キナーゼ阻害剤の標的関与である。
これまで、インビボにおけるLRRK2阻害剤の主な薬物動態マーカーは、LRRK2の構成的にリン酸化されたセリン残基のクラスターであり、特にセリン935は、多様なLRRK2阻害剤88,99に応答して脱リン酸化される。しかしながら、セリン935リン酸化は、LRRK2によって直接リン酸化されておらず、キナーゼ不活性LRRK210中に依然としてリン酸化されているため、固有の細胞LRRK2キナーゼ活性と相関しない。LRRK2キナーゼ活性はセリン1292の自己リン酸化とよく相関するが、実際には、この部位10,11,11に対する信頼できる、そしてホスホ特異的抗体の現在の欠如による全細胞抽出物の免疫ブロット分析による内因性LRRK2キナーゼ活性に適した読み出しではない。
我々は、ヒト末梢血細胞におけるLRRK2キナーゼ経路活性を定量化するための堅牢で容易なアッセイを開発し、その生理学的標的タンパク質Rab10のリン酸化をスレオニン7311で測定した。末梢血は、最小限の不快感を引き起こす低リスクかつ迅速な手順である静脈切除によって容易にアクセス可能である。ヒト末梢血好中球は、LRRK2とRab1011の両方の比較的高いレベルを発現する豊富な(全白血球の37~80%)と均質な細胞集団を構成するため、我々は注目する。さらに、末梢血好中球は、免疫磁気陰性アプローチを採用することにより、迅速かつ効率的に単離することができる。その後観察されたRab10リン酸化がLRRK2によって媒介されることを確実にするために、好中球の各バッチは、強力で選択的なLRRK2キナーゼ阻害剤の有無にかかわらずインキュベートされる(我々はMLi-2を使用し、推奨する)2、12。,12この後、プロテアーゼ阻害剤ジイソプロピルフルオロリン酸塩(DIFP)を含む緩衝液中の細胞溶出が続き、好中球13において高くすることが知られているセリンプロテアーゼ活性を抑制するために必要である。定量免疫ブロット法による最終分析では、Rab10 Thr73-ホスホエピトープを特異的に検出し、他のリン酸化ラブタンパク質14と交差反応しないMJFF-pRab10ウサギモノクローナル抗体を用いることにお勧めします。この抗体の選択性と特異性は、異なるRabタンパク質の過剰発現モデルおよびA549 Rab10ノックアウト細胞ライン14において検証されている。従って、強力かつ選択的なLRRK2キナーゼ阻害剤2の有無にかかわらず治療された好中球の溶血体におけるRab10リン酸化の差を測定する。あるいは、定量質量分析などの他の方法によってサンプルを分析することもできる。
結論として、LRRK2制御のRab10リン酸化は、セリン935におけるLRRK2リン酸化に対するLRRK2キナーゼ活性の優れたマーカーであり、ヒト末梢血好中球は、LRRK2に関するPD研究の貴重なリソースである。我々のプロトコルは、末梢血好中球中のLRRK2経路活性を問い合わすために堅牢で容易なアッセイを提供し、LRRK2キナーゼ活性15を増加した個体の生化学的階層化を可能にする。重要なことに、このような個体は、将来のLRRK2キナーゼ阻害剤治療の恩恵を受ける可能性がある。
Protocol
Representative Results
Discussion
説得力のある臨床、遺伝学的、生化学的証拠は、LRRK2の重要な役割、特にパーキンソン病におけるキナーゼ機能を指摘する。LRRK2キナーゼ阻害剤が開発され、臨床試験2、4、124,に入っています。そのため、患者層層と同様に、標的エンゲージメントのバイオマーカーとしてLRRK2を利用する必要があります。…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
今回の研究に献血してくれた健康なボランティアに感謝します。私たちは、パーキンソン病研究のためのマイケル・J・フォックス財団(MJFF)とフォックスバイオネット研究リーダーシップ(FBN)に、書面によるプロトコルとビデオに対する彼らの支援とインプットに感謝します。オーストリアのウィーン大学のアレクサンダー・ジンプリッヒ教授に、私たちのプロトコルとコラボレーションをテストしてくれたことに感謝します。私たちは、プロジェクト(MRC PPUのゼネラルマネージャー)にポール・デイヴィスの貢献を大切にしています。また、MRCタンパク質リン酸化およびユビキタス化ユニット(PPU)、すなわち化学合成(MLi-2を合成するためのナタリア・シュピロ)、MRC PPU試薬およびサービス抗体精製チーム(によって調整された)の優れた技術サポートを認識しています(ヒラリー・マクラウクランとジェームズ・ハスティ)。私たちは、ビデオやアニメーションを作る彼らの助けをビボモーションからマヘリ・トウラーとフレイザーマードックに感謝します。私たちは、最終的な編集の支援のために81の映画からスティーブ・ソアヴェに感謝します。エステル・サムラーは、スコットランドのシニア・クリニカル・アカデミック・フェローシップの支援を受けており、パーキンソン病の英国(K-1706)から資金を受け取っています。
Materials
| 1 mL Pipette tips | Sarstedt | 70.762 | or equivalent |
| 1.5 mL Micro tubes | Sarstedt | 72.690.001 | or equivalent |
| 10 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1254.025 | or equivalent |
| 10 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.113 | or equivalent |
| 15 mL falcon tube | Cellstar | 188 271 | or equivalent |
| 200 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | or equivalent |
| 25 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1685.001 | or equivalent |
| 50 mL falcon tube | Cellstar | 227 261 | or equivalent |
| BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube | BD | BD 367525 | or equivalent |
| Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge | Beckman | or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g | |
| Category 2 biological safety cabinet. | |||
| cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| DIFP (Diisopropylfluorophosphate) | Sigma | D0879 | Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | 6250 | |
| Dry ice or liquid nitrogene | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190094 | or equivalent |
| Easy 50 EasySep Magnet | Stemcell | 18002 | for holding 1 x 50ml conical tube |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit | Stemcell | 19666 | This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge | Eppendorf | ||
| Ethanol, in spray bottle | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Ice | |||
| Isopropanol (anhydrous grade) | Sigma | 278475 | |
| Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP). | alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/) | ||
| Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) | Merck | 438194-10MG | or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor) |
| Microcystin-LR | Enzo Life Sciences | ALX-350-012-M001 | 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. |
| Na3VO4 | Aldrich | 450243 | |
| NaF | Sigma | S7920 | |
| Odyssey CLx scan Western Blot imaging system | Odyssey | ||
| Permanent marker pen | |||
| Personal protection equipment | |||
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher | 21875034 | or equivalent |
| sodium pyrophosphate | Sigma | S22 | |
| sucrose | Sigma | S0389 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | 50020 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Suggested antibodies for Western blotting | |||
| Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] | abcam | ab230261 | |
| Anti-α-tubulin | Cell Signaling Technologies | 5174 | used at 1:2000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 680LT | LI-COR | 926-68020 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 800CW | LI-COR | 926-32210 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR | 926-32211 | used at 1:10,000 dilution |
| MJFF-total Rab10 mouse antibody | generated by nanoTools (nanotools.de) | not applicable* | used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018 |
| Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody | Antibodies Incorporated | 75-253 | used at 1 μg/ml final concentration |
| pS935-LRRK2 | MRC PPU Reagents and Services | UDD2 | MJFF-total Rab10 mouse antibody |
Referencias
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