Summary

Isolamento de neutrófilos de sangue periférico humano para interrogar o Caminho Associado lRRK2 Kinase de Parkinson avaliando rab10 fosforilação

Published: March 21, 2020
doi:

Summary

Mutações no rico gene de leucina repetição quinase 2 (LRRK2) causam doença hereditária de Parkinson. Desenvolvemos um método fácil e robusto para avaliar a fosforilação controlada por LRRK2 de Rab10 em neutrófilos de sangue periféricos humanos. Isso pode ajudar a identificar indivíduos com aumento da atividade da via de quinase LRRK2.

Abstract

A rica incidência de quinase 2 (LRRK2) é o gene mais frequentemente mutado na doença hereditária de Parkinson (DP) e todas as mutações lRRK2 patogênicas resultam na hiperativação de sua função quinase. Aqui, descrevemos um ensaio fácil e robusto para quantificar a atividade da via de quinase LRRK2 em neutrófilos de sangue periférico sénior humano medindo a fosforilação controlada por LRRK2 de um de seus substratos fisiológicos, Rab10 at threonine 73. A análise imunoblotting descrita requer um anticorpo totalmente seletivo e fosforespecífico que reconhece o rab10 Thr73 fosforilado por LRRK2, como o anticorpo monoclonal de coelho MJFF-pRab10. Ele usa neutrófilos de sangue periféricos humanos, porque o sangue periférico é facilmente acessível e os neutrófilos são um constituinte abundante e homogêneo. É importante ressaltar que os neutrófilos expressam níveis relativamente altos tanto de LRRK2 quanto de Rab10. Uma desvantagem potencial dos neutrófilos é sua alta atividade protease serinica intrínseca, que requer o uso de inibidores de protease muito potentes, como o organophosphorus neurotoxin diisopropilfluorofosfato (DIFP) como parte do tampão de lise. No entanto, os neutrófilos são um recurso valioso para a pesquisa sobre a atividade da via de quinase LRRK2 in vivo e devem ser considerados para inclusão em coleções biorepositórias de DP.

Introduction

As tentativas de retardar ou parar a doença de Parkinson (DP) falharam até agora. A descoberta de mutações hiperativanas na rica incidência repetição quinase 2 (LRRK2) que causam e/ou aumentam o risco de DP levou ao desenvolvimento de inibidores de quinase LRRK21,2,3. Estes já entraram em ensaios clínicos4. A função exata do LRRK2 não é clara, mas um grande avanço tem sido a identificação de um subconjunto de proteínas Rab GTPase, incluindo Rab10, como os primeiros substratos fisiológicos de boa fé da quinase LRRK25,6,7. Os principais desafios na era da terapêutica modificadora de doenças são marcadores bioquímicos do status de ativação da quinase LRRK2 e o engajamento alvo dos inibidores da quinase LRRK2.

Até agora, o principal marcador farmacocinético para inibidores LRRK2 in vivo tem sido um aglomerado de resíduos serinas constitutivamente fosforilados de LRRK2, em particular serino 935, que se tornam defosforilados em resposta aos diversos inibidores lRRK28,9. No entanto, a fosforilação serina 935 não se correlaciona com a atividade intrínseca celular LRRK2 quinase porque não é diretamente fosforilada por LRRK2 e ainda é fosforilada em quinase-inativa LRRK210. A atividade de quinase LRRK2 correlaciona-se bem com a autofosforilação de serina 1292, mas não é em termos práticos uma leitura adequada para a atividade endógena lRRK2 quinase por análise imunoblot de extratos celulares inteiros devido à atual falta de anticorpos confiáveis e fosfoespecíficos para este site10,11.

Desenvolvemos um ensaio robusto e fácil para quantificar a atividade da via de quinase LRRK2 em células sanguíneas periféricas humanas que mede a fosforilação controlada por LRRK2 de sua proteína alvo fisiológica Rab10 em threonine 7311. O sangue periférico é facilmente acessível por venesection, que é um procedimento de baixo risco e rápido que causa desconforto mínimo. Focamos em neutrófilos de sangue periféricos humanos porque eles constituem uma população abundante (37-80% de todos os glóbulos brancos) e células homogêneas que expressam níveis relativamente altos tanto de LRRK2 quanto de Rab1011. Além disso, os neutrófilos sanguíneos periféricos podem ser isolados de forma rápida e eficiente, empregando uma abordagem negativa imunomagnética. Para garantir que a fosforilação rab10 subseqüente observada seja mediada por LRRK2, cada lote de neutrófilos é incubado com ou sem um potente e seletivo inibidor de quinase LRRK2 (usamos e recomendamos MLi-2)2,12. Isso é seguido por lise celular em um tampão contendo o inibidor de protease fluorofosfato de diisopropílico (DIFP), que é necessário para suprimir a atividade de protease serina intrínseca que é conhecida por ser alta em neutrófilos13. Para a análise final por imunoblotação quantitativa, recomendamos o uso do anticorpo monoclonal de coelho MJFF-pRab10 que detecta especificamente o Rab10 Thr73-phosphoepitope e não reage cruzadamente com outras proteínas rab fosforiladas14. A seletividade e especificidade deste anticorpo foi validada em modelos de superexpressão de diferentes proteínas Rab e uma linha de células knock-out A549 Rab1014. Assim, medimos a diferença na fosforilação rab10 em lisatos neutrófilos que foram tratados com e sem um potente e seletivo inibidor de quinase LRRK22. Alternativamente, as amostras também poderiam ser analisadas por outros métodos, como espectrometria de massa quantitativa.

Em conclusão, a fosforilação rab10 controlada por LRRK2 é um marcador superior da atividade de quinase LRRK2 à fosforilação LRRK2 na serina 935 e os neutrófilos de sangue periféricos humanos são um recurso valioso para a pesquisa de PD em LRRK2. Nosso protocolo fornece um ensaio robusto e fácil para interrogar a atividade da via LRRK2 em neutrófilos sanguíneos periféricos e permite a estratificação bioquímica de indivíduos com aumento da atividade de quinase LRRK215. É importante ressaltar que esses indivíduos podem se beneficiar de futuros tratamentos inibidores de quinase LRRK2.

Protocol

De acordo com a regulamentação local do Reino Unido, todas as manipulações e pipetting de sangue humano são realizadas em um gabinete de segurança biológica de categoria 2. Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com o conselho de ética local e todos os participantes forneceram consentimento informado. 1. Preparação Prepare 0,1 mL de EDTA Stock Solution 1 contendo EDTA de 100 mM em solução salina tamponada por fosfato (PBS). Preparar 60 mL de EDT…

Representative Results

Nosso ensaio permite interrogar a ativação da quinase LRRK2 associada ao PD em neutrófilos de sangue periférico humano com a fosforilação Rab10 dependente de LRRK2 como leitura. Os neutrófilos são uma população homogênea e abundante de glóbulos brancos periféricos que expressa altos níveis tanto das proteínas LRRK2 quanto Rab10(Figura 1). A única outra população celular entre as células mononucleares periféricas remanescentes (PBMCs) com alto número de cópias de ambas a…

Discussion

Evidências clínicas, genéticas e bioquímicas convincentes apontam para um papel importante para o LRRK2 e, em particular, sua função quinase na doença de Parkinson7. Os inibidores da quinase LRRK2 foram desenvolvidos e estão entrando em ensaios clínicos2,4,12. Como tal, há a necessidade de explorar o LRRK2 como um biomarcador para o engajamento do alvo, bem como a estratificação do paciente. N…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos aos voluntários saudáveis que gentilmente doaram sangue para o presente estudo. Agradecemos à Michael J. Fox Foundation for Parkinson’s Research (MJFF) e à liderança do estudo Fox BioNet (FBN) pelo apoio e contribuição ao protocolo escrito e ao vídeo. Agradecemos ao professor Alexander Zimprich, da Universidade de Viena, na Áustria, por testar nosso protocolo e colaboração. Valorizamos as contribuições de Paulo Davies para o projeto (gerente geral da PPU MRC). Também reconhecemos o excelente suporte técnico das equipes de purificação de anticorpos e de Fosforilação de Proteína mrc (PPU), ou seja, Síntese Química (Natalia Shpiro para sintetização MLi-2), Reagentes de Reagentes e Serviços de Purificação de Mrc PPU (coordenados por equipes de purificação de anticorpos (coordenadas por equipes de purificação de anticorpos do MRC PPU e Services (coordenadas por equipes de purificação de anticorpos (coordenadas por Hilary McLauchlan e James Hastie). Agradecemos a Mhairi Towler e Fraser Murdoch da Vivomotion por sua ajuda na produção dos vídeos e animações. Agradecemos a Steve Soave, de 81 filmes, pela ajuda com as edições finais. Esther Sammler é apoiada por uma Bolsa Acadêmica Clínica Clínica Sênior Escocesa e recebeu financiamento do Reino Unido de Parkinson (K-1706).

Materials

1 mL Pipette tips Sarstedt 70.762 or equivalent
1.5 mL Micro tubes Sarstedt 72.690.001 or equivalent
10 mL Pipette tips  Sarstedt 86.1254.025  or equivalent
10 μL Pipette tips Sarstedt 70.113 or equivalent
15 mL falcon tube  Cellstar 188 271 or equivalent
200 μL Pipette tips Sarstedt 70.760.002 or equivalent
25 mL Pipette tips  Sarstedt 86.1685.001 or equivalent
50 mL falcon tube  Cellstar 227 261 or equivalent
BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube BD  BD 367525 or equivalent
Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge Beckman or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g
Category 2 biological safety cabinet.
cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail Roche 11836170001
DIFP (Diisopropylfluorophosphate)  Sigma D0879 Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions 
Dimethyl sulfoxide  Sigma 6250
Dry ice or liquid nitrogene
Dulbecco's phosphate-buffered saline  ThermoFisher 14190094 or equivalent
Easy 50 EasySep Magnet  Stemcell 18002 for holding 1 x 50ml conical tube
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit  Stemcell 19666 This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads
EGTA Sigma E3889
Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge Eppendorf
Ethanol, in spray bottle
Ethylenediaminetetraacetic acid  Sigma E6758
Ice
Isopropanol (anhydrous grade)  Sigma 278475
Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP).  alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)
Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) Merck 438194-10MG or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor)
Microcystin-LR Enzo Life Sciences ALX-350-012-M001 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. 
Na3VO4 Aldrich 450243
NaF Sigma S7920
Odyssey CLx scan Western Blot imaging system Odyssey
Permanent marker pen
Personal protection equipment
RPMI 1640 Medium  ThermoFisher 21875034 or equivalent
sodium pyrophosphate Sigma S22
sucrose Sigma S0389
β-glycerophosphate Sigma 50020
β-mercaptoethanol Sigma M3148
Suggested antibodies for Western blotting
Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] abcam ab230261
Anti-α-tubulin Cell Signaling Technologies 5174 used at 1:2000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 680LT LI-COR 926-68020 used at 1:10,000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 800CW LI-COR 926-32210 used at 1:10,000 dilution
Goat anti-rabbit IRDye 800CW LI-COR 926-32211 used at 1:10,000 dilution
MJFF-total Rab10 mouse antibody generated by nanoTools (nanotools.de) not applicable* used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018
Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody Antibodies Incorporated  75-253 used at 1 μg/ml final concentration
pS935-LRRK2 MRC PPU Reagents and Services UDD2 MJFF-total Rab10 mouse antibody

Referencias

  1. Paisan-Ruiz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson’s disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
  2. Fell, M. J., et al. MLi-2, a Potent, Selective, and Centrally Active Compound for Exploring the Therapeutic Potential and Safety of LRRK2 Kinase Inhibition. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 397-409 (2015).
  3. Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
  4. Sardi, S. P., Cedarbaum, J. M., Brundin, P. Targeted Therapies for Parkinson’s Disease: From Genetics to the Clinic. Journal of Movement Disorders. 33 (5), 684-696 (2018).
  5. Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson’s disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
  6. Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochemical Journal. 473 (17), 2671-2685 (2016).
  7. Alessi, D. R., SammLer, E. LRRK2 kinase in Parkinson’s disease. Science. 360 (6384), 36-37 (2018).
  8. Yue, M., et al. Progressive dopaminergic alterations and mitochondrial abnormalities in LRRK2 G2019S knock-in mice. Neurobiology of Disease. 78, 172-195 (2015).
  9. Doggett, E. A., Zhao, J., Mork, C. N., Hu, D., Nichols, R. J. Phosphorylation of LRRK2 serines 955 and 973 is disrupted by Parkinson’s disease mutations and LRRK2 pharmacological inhibition. Journal of Neurochemistry. 120 (1), 37-45 (2012).
  10. Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Science Translational Medicine. 4 (164), (2012).
  11. Fan, Y., et al. Interrogating Parkinson’s disease LRRK2 kinase pathway activity by assessing Rab10 phosphorylation in human neutrophils. Biochemical Journal. 475 (1), 23-44 (2018).
  12. Scott, J. D., et al. Discovery of a 3-(4-Pyrimidinyl) Indazole (MLi-2), an Orally Available and Selective Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Inhibitor that Reduces Brain Kinase Activity. Journal of Medicinal Chemistry. 60 (7), 2983-2992 (2017).
  13. Pham, C. T. Neutrophil serine proteases: specific regulators of inflammation. Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).
  14. Lis, P., et al. Development of phospho-specific Rab protein antibodies to monitor in vivo activity of the LRRK2 Parkinson’s disease kinase. Biochemical Journal. 475 (1), 1-22 (2018).
  15. Mir, R., et al. The Parkinson’s disease VPS35[D620N] mutation enhances LRRK2-mediated Rab protein phosphorylation in mouse and human. Biochemical Journal. 475 (11), 1861-1883 (2018).
  16. Rieckmann, J. C., et al. Social network architecture of human immune cells unveiled by quantitative proteomics. Nature Immunology. 18 (5), 583-593 (2017).
  17. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
  18. Bain, B., Dean, A., Broom, G. The estimation of the lymphocyte percentage by the Coulter Counter Model S Plus III. Clinical & Laboratory Haematology. 6 (3), 273-285 (1984).
  19. Tomazella, G. G., et al. Proteomic analysis of total cellular proteins of human neutrophils. Proteome Science. 7, 32 (2009).

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Citar este artículo
Fan, Y., Tonelli, F., Padmanabhan, S., Baptista, M. A., Riley, L., Smith, D., Marras, C., Howden, A., Alessi, D. R., Sammler, E. Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson’s Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation. J. Vis. Exp. (157), e58956, doi:10.3791/58956 (2020).

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