Avancée d’imagerie du poumon Homing des Lymphocytes humains dans un modèle In Vivo de l’Inflammation allergique, issue des feuilles lumière microscopie expérimentale

Summary

Le protocole introduit ici permet la caractérisation de la capacité de radioralliement pulmonaire des lymphocytes humains primaires dans des conditions inflammatoires in vivo. Une infiltration pulmonaire des cellules immunitaires humaines moutschen transférés dans un modèle murin d’inflammation allergique peut être imagée et quantifiée par microscopie à fluorescence lumière-feuille de tissu pulmonaire chimiquement défrichées.

Abstract

Accumulation dans les tissus de cellules immunitaires activées hautement représente une caractéristique de diverses maladies inflammatoires chroniques et a émergé comme une cible thérapeutique séduisante dans la prise en charge clinique des patients affectés. Afin d’optimiser les stratégies visant à un règlement thérapeutique de l’infiltration des tissus pathologiquement déséquilibrée des cellules immunitaires pro-inflammatoires, il sera particulièrement important pour atteindre les aperçus améliorés en maladie et organe-spécifiques propriétés homing des lymphocytes périphériques. Le protocole expérimental décrit ici permet de contrôler l’accumulation des lymphocytes humains fluorescent étiquetés et moutschen transférés dans le cadre d’une inflammation pulmonaire induite par la papaïne poumon. Contrairement aux tests in vitro standards fréquemment utilisés pour l’analyse de la migration des cellules immunitaires et la chimiotaxie, le paramètre in vivo maintenant introduit tienne compte des aspects spécifiques du poumon d’organisation tissulaire et l’influence du complexe inflammatoire scénario qui se déroulent dans l’organisme murine vivant. En outre, imagerie microscopique en trois dimensions transversales lumière-feuille fluorescence ne fournit pas uniquement des données quantitatives sur l’infiltration de cellules immunitaires, mais représente aussi le modèle de la localisation des cellules immunitaires dans l’inflammation pulmonaire. Dans l’ensemble, nous sommes en mesure de présenter une technique innovante de haute valeur pour la recherche immunologique dans le domaine des pneumopathies inflammatoire chronique, qui peut être facilement appliqué en suivant le protocole étape par étape fourni.

Introduction

Troubles inflammatoires classiques du poumon, telles que l’asthme allergique et la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), sont bien connus pour être chassés par un augmentation du recrutement des lymphocytes activés dans le tissu pulmonaire^1,2. Les cytokines lymphocytes-réalisé (par exemple, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ et TNF-α) promouvoir davantage le chimiotactisme des cellules immunitaires innées et adaptatives, induire de remodelage des voies aériennes fibreuses ou endommager directement le poumon parenchyme². Jusqu’à présent, les mécanismes sous-jacents responsables de l’accumulation pathologique des lymphocytes dans les tissus pulmonaires ne sont pas encore bien compris. Par analogie avec l’empreinte de tissus sélective des cellules T pour le homing gut et cutanée, pulmonaires cellules dendritiques (CD) sont évidemment en mesure d’amorcer des cellules T périphériques pour l’infiltration pulmonaire préférentiels, au moins en partie par l’intermédiaire de l’induction de l’expression CCR4 sur la surface des lymphocytes³. Outre CCR4, voies respiratoires-infiltration des lymphocytes T sont également caractérisés par une expression particulièrement accrue des récepteurs chimiokines CCR5 et CXCR3 par rapport aux cellules T dans le sang périphérique^1,4,5. Dans l’ensemble, les données sont compatibles avec le concept que homing poumon des lymphocytes T dans des conditions physiologiques ou inflammatoires implique un certain nombre de récepteurs de chimiokines différents et leurs ligands respectifs et donc dépend une étroite collaboration contrôlé la collaboration entre cellules immunitaires innée et adaptative¹. En particulier, au cours de la phase initiale d’exposition pathogène ou allergène, les cellules du système immunitaire inné répondent à stimulation TLR ou à médiée par les IgE réticulation par la libération immédiate des chimioattractants différents, comme LTB₄, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 et PGD₂^1,6,7. Comme un excellent exemple, l’interaction entre PGD₂ et le récepteur du facteur chimiotactique CRTh2 est connu pour être d’une importance particulière pour le chimiotactisme des cellules Th2 et apparaît donc aussi prometteur cible thérapeutique dans la prise en charge clinique de l’asthme. En effet, les patients souffrant d’asthme modéré a montré une amélioration des symptômes et une augmentation significative du volume expiratoire forcé en une seconde (VEMS₁) après le traitement avec un antagoniste sélectif de CRTh2 par rapport au groupe placebo^{8 ,9}. Dans un état plus ont progressé de la réponse inflammatoire, déjà recruté des lymphocytes T sont capables d’augmenter davantage accumulation pulmonaire lymphocytaire via la libération d’IL-4 et IL-13 comme stimulus puissants pour des contrôleurs de domaine pulmonaires. Par la suite, ces cellules myéloïdes innées de la régulation l’expression de CCL17 et CCL22 dans une fonction STAT6 manière^1,10,11.  Bien que la complexité du scénario décrit empêche toujours une compréhension complète de poumon de cellules de T d’autoguidage, elle offre une multitude de cibles moléculaires pour un contrôle optimisé potentiellement thérapeutique des maladies pulmonaires inflammatoires ou allergiques. Par conséquent, il y a un besoin urgent de techniques expérimentales novatrices, qui sont en mesure d’approfondir et compléter nos connaissances dans le domaine du chimiotactisme des cellules T et domiciliation de poumon.

Due au fait que homing poumon des lymphocytes dans le corps humain est influencé par plusieurs paramètres physiques, humorale et cellulaire¹, la plupart des méthodes expérimentales existantes n’est pas en mesure de modéliser la complexité entière de ce processus immunologique. Au lieu de cela, beaucoup de protocoles normalisés pour l’analyse du poumon homing sélectivement se concentrent sur un aspect précis impliqué dans la cascade d’attraction lymphocytaire, adhésion, la migration et rétention. Outre une décision purement descriptive du ARNm ou protéine modèle expression des intégrines et chemokine récepteurs sur les lymphocytes périphériques ou poumon-infiltration et la mesure complémentaire des niveaux respectifs de chemokine dans le sang, lavage broncho-alvéolaire (LBA) ou tissu pulmonaire^12,13,14,15, essais de culture in vitro de cellules bien établies permettent une caractérisation fonctionnelle de l’adhérence des lymphocytes ou chimiotactisme dès défini des conditions expérimentales^16,17,18. En principe, tests d’adhérence in vitro statique surveillent la capacité de liaison des lymphocytes cultivés à une monocouche endothéliale ou à lames en verre recouverts de molécules d’adhérence endothéliales recombinante (p. ex., MAdCAM-1, VCAM-1), alors que norme in vitro la chimiotaxie dosages sont généralement appliqués pour quantifier la capacité des lymphocytes à migrent le long d’un gradient de chemokine dans un système de transwell¹⁹. Les deux paramètres in vitro permettent un ajustement contrôlé et la modulation des conditions expérimentales, mais n’ont pas d’autre part des variables importantes qui critique les répercussions sur la chimiotaxie in vivo et l’adhérence des lymphocytes. Essentiellement, des essais de culture des cellules statiques ne pas tenir compte de l’influence des forces de cisaillement provoquées par le flux de sang permanent¹⁹ et potentiellement négligent l’implication du milieu immunologique environnante et interaction des cellules immunitaires des lymphocytes, tous deux présents dans un organisme vivant. Afin de surmonter ces limitations, l’interprétation des résultats acquis en statiques essais in vitro de chimiotactisme et de l’adhérence besoin encore validation dans des expériences d’adhérence dynamiques sous des conditions de débit^20,21 et en Vivo modèles de pathologie inflammatoire orgue¹⁹. En effet, important pourraient tirer des conclusions sur la régulation de poumon de cellules de T d’autoguidage dans des conditions inflammatoires ou allergiques provenant d’études animales analyser génétiquement modifié souris dans des modèles définis de différentes maladies pulmonaires^{3, 22 , 23}. la comparaison quantitative du poumon infiltration lymphocytes entre les souris de type sauvage et des souris ayant un déficit pour un gène spécifique d’intérêt représente un outil bien établi et largement utilisé pour définir l’impact du cellulaire particulière voies ou récepteurs sur le modèle axée sur la maladie de distribution de cellules T. Cependant, contrairement à avant discuté des essais de culture cellulaire in vitro, une conception de l’étude basée sur des modèles animaux classiques n’a pas la capacité d’analyser et de surveiller des cellules T humaines primaires directement dérivés du sang ou le BAL des patients souffrant d’une inflammation pulmonaire maladie. Ainsi, il reste encore difficile à valider sur le plan fonctionnel si une maladie pulmonaire diagnostique spécifié est apte imprimer des lymphocytes humains de tropisme préférentiel pulmonaire et dans quelle mesure les paramètres cliniques peuvent influer sur ce scénario. Récemment, une approche très élégante in vivo a été introduite dans le cadre des maladies inflammatoires de l’intestin (MII), qui est parvenue à surmonter la plupart de ces limitations et ouvert de nouvelles avenues de hautes études translationnelles sur lymphocytes intestinaux homing²⁴ . Profitant des protocoles pour la compensation des tissus à base de solvants suivie de fluorecence feuilles lumière transversale comme un puissant outil d’imagerie, il était possible de visualiser les infiltrations et la distribution de cellules de T humaines moutschen transférés dans l’intestin des souris immunodéficientes colitic²⁴. En particulier, ce paramètre expérimental mis en place deux innovations principales : (1) des cellules immunitaires humaines primaires peuvent être analysés dans des conditions déterminées expérimentalement in vivo ; (2) une assez grande surface de l’organe malade (environ 1,5 x 1,5 cm) peut être photographiée en qualité haute résolution, suivie de reconstruction 3D. En outre, plusieurs études récentes établi avec succès l’utilisation de tissus à base de solvant de compensation et la microscopie de fluorescence lumière-feuille comme des outils importants pour poumon avancé d’imagerie^25,26. Pour bénéficier de cette avancée technologique dans le domaine de l’immunologie pulmonaire, nous avons adopté maintenant le système d’analyse des homing de poumon.

Le protocole présenté ici constitue une introduction étape par étape comment purifier et fluorescent étiquette primaire T humain cellules pour le transfert à des souris avec une inflammation pulmonaire induite et, en outre, décrit en détail le processus ultérieur de lumière-feuille microscopiques imagerie de fluorescence, y compris la préparation de l’orgue et de traitement d’image. Dans l’ensemble, nous espérons pouvoir soutenir les futures études translationnelles dans le domaine des maladies pulmonaires inflammatoires ou allergiques en introduisant une sophistiqué, mais néanmoins réalisable modèle expérimental de surveillance homing poumon lymphocytes humains conditions in vivo.

Protocol

Dans les expériences impliquant des animaux ont été réalisés conformément aux protocoles approuvés par les autorités locales compétentes à Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Allemagne). Souris ont été logés dans des conditions spécifiques exempts de micro-organismes pathogènes. La collecte de sang humain a été approuvée par le comité local d’éthique et de la Commission de révision institutionnelle de l’Université d’Erlangen-Nuremberg. Chaque patient a donné consentement éclair?…

Representative Results

Le protocole présenté décrit un modèle expérimental de souris, qui permet la surveillance et quantification de l’accumulation de moutschen transféré les lymphocytes T humains dans les poumons par l’intermédiaire de la microscopie en fluorescence lumière-feuille. Figure 1 A fournit un aperçu schématique des étapes de la planification expérimentale in vivo. Afin de garantir des résultats fiables, il est d’une importance essentielle pour assurer une bonne q…

Discussion

Le paramètre expérimental décrit ici offre la possibilité de contrôler la capacité de radioralliement pulmonaire des principales cellules immunitaires humaines sous des conditions inflammatoires in vivo et donc pertinente compléments classiquement effectuée chimiotactisme et adhérence in vitro dosages. Pour prendre en compte les caractéristiques spécifiques organe anatomique du poumon, des aspects importants de cellules immunitaires d’autoguidage (incluant la distribution de chim…

Materials

Agarose NEEO Ultra	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	2267.4
AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody	BioLegend, San Diego, USA	304060
Ammonium chloride	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	K2981
Cannula 21 G	Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA	301300
Cell proliferation dye eflour670	eBioscience Inc., San Diego, USA	65-0840-85
CD4 MicroBeads, human	Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany	130-045-101
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	8043.1
Potassium-EDTA blood collection tube, 9 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	21066001
Ethly cinnamate (ECi)	Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany	112372-100G
Ethanol ≥ 99.5 % (EtOH)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	5054.3
FBS (fetal bovine serum) Good Forte	PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany	P40-47500
Filter 100 µm	VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany	732-2758
Imaris Image Analysis Software 9.0.2	Bitplane AG, Zurich, Switzerland	n.a.
ImspectorPro software	Abberior Instruments GmbH, Göttingen, Germany	n.a.
Ketamin	Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany	3617KET-V
LaVision UltraMicroscope II	LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany	n.a.
MACS MultiStand	Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany	130-042-303
Multifly cannula 20 G	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	851638035
30 G needle	B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany	9161502
Neubauer counting chamber	neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	C-1003
Pattex Glue	Henkel AG & Co, Düsseldorf, Germany	PSK1C
LS column	Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany	130-042-401
Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/ml)	anprotec	AC-AF-0018
RPMI medium	(Gibco) Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany	61870-010
Papain	Merck	1,071,440,025
PBS Dulbecco (phosphate buffered saline)	Biochrom GmbH, Berlin, Germany	L182-10
PerCP/Cy5.5 anti-human CD4	BioLegend, San Diego, USA	317428
PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, κ isotype Ctrl	BioLegend, San Diego, USA	400337
PFA (paraformaldehyde)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	0335.1
Potassium hydrogen carbonate	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	P7481
Serological pipette 10 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	86.1254.001
Syringe 1 ml	B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany	9166017V
Syringe 5 ml	Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA	260067
Syringe 20 ml	Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA	260069
Tube 1.5 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	72,706,400
Tube 2 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	72.695.400
Tube 2 ml, brown	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	72,695,001
Tube 15 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	62.554.502
Tube 50 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	62.547.254
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany	130-090-976
Xylazin (Rompun 2%)	Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany	KPOBD32