Formazione immagine dei linfociti umani di Homing polmonare in un sperimentale In Vivo modello di infiammazione allergica basato su microscopia luce-scheda Avanzate

Summary

Il protocollo introdotto qui permette la caratterizzazione della capacità polmonare homing dei linfociti primari umani sotto condizioni infiammatorie in vivo. Infiltrazione polmonare delle cellule immuni umane passivamente trasferite in un modello murino di infiammazione allergica può essere imaged e quantificato mediante microscopia a fluorescenza di luce-foglio di tessuto polmonare chimicamente deselezionata.

Abstract

Accumulazione del tessuto delle cellule immuni altamente attivate in modo schiacciante rappresenta un segno distintivo di varie malattie infiammatorie croniche ed emerso come un obiettivo terapeutico attraente nella gestione clinica dei pazienti affetti. Al fine di ottimizzare ulteriormente le strategie finalizzate a regolamento terapeutico di infiltrazione del tessuto patologico squilibrata delle cellule immuni pro-infiammatorie, sarà di particolare importanza per il raggiungimento di migliori intuizioni in malattia organo-specifiche e Proprietà Homing dei linfociti periferici. Il protocollo sperimentale descritto qui permette di polmone accumulo di linfociti umani fluorescente contrassegnati e passivamente trasferiti nel contesto di infiammazione polmonare indotta da papaina. In contrasto con l’analisi in vitro standard si è frequentemente utilizzata per l’analisi di chemiotassi e migrazione delle cellule immuni, l’impostazione ora introdotto in vivo tiene conto di aspetti specifici del polmone dell’organizzazione del tessuto e l’influenza del complesso infiammatorio scenario che si svolgono nell’organismo vivente murino. Inoltre, imaging microscopica tridimensionale a sezione trasversale luce-foglio fluorescenza non fornisce solo dati quantitativi su infiltrazione di cellule immuni, ma raffigura anche il modello di localizzazione delle cellule immuni all’interno del polmone infiammato. Nel complesso, siamo in grado di introdurre una tecnica innovativa di alto valore per le ricerche immunologiche nel campo delle malattie polmonari croniche infiammatorie, che può essere facilmente applicato seguendo il protocollo fornito dettagliato.

Introduction

Classici disordini infiammatori del polmone, come l’asma allergica e broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), sono ben noti per essere guidato da un aumentato reclutamento di linfociti attivati nel tessuto polmonare^1,2. Linfocita-rilasciato citochine (ad es., IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ e TNF-α) promuovere ulteriormente la chemiotassi di cellule immuni innate ed adattabili, indurre fibrotica vie respiratorie che ritoccano o direttamente danneggiare il parenchima polmonare². Finora, i meccanismi di fondo responsabili dell’accumulo patologico dei linfociti all’interno del tessuto polmonare ancora completamente non sono capiti. In analogia al tessuto-selettivo delle cellule di T imprinting descritto per homing intestinale e della pelle, polmonare cellule dendritiche (DCs) sono ovviamente in grado di prime cellule di T periferiche per infiltrazione polmonare preferenziale, almeno in parte tramite l’induzione dell’espressione di CCR4 sul superficie di linfociti³. Oltre CCR4, delle vie respiratorie-infiltrazione di cellule T sono anche caratterizzate da una particolare aumentata espressione dei recettori chemochinici CCR5 e CXCR3 rispetto alle cellule di T all’interno il sangue periferico^1,4,5. Nel complesso, esistenti dati sono coerenti con il concetto che polmone homing dei linfociti T in condizioni fisiologiche o infiammatorie coinvolge un numero di recettori per le chemochine diversi e loro rispettivi ligandi e così fondamentalmente dipende un strettamente controllata la collaborazione tra le cellule immuni innate ed adattabili¹. Soprattutto, durante la fase iniziale dell’esposizione dell’agente patogeno o allergene, cellule del sistema immunitario innato rispondono alla stimolazione dei TLR o di IgE-mediata reticolazione dell’immediato rilascio di chemioattrattanti differenti, come LTB₄, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 e PGD₂^1,6,7. Come un primo esempio, l’interazione tra PGD₂ e il recettore chemoattractant CRTh2 è noto per essere di particolare importanza per chemiotassi di cellule Th2 e così è comparso come promettente bersaglio terapeutico nell’amministrazione clinica di asma. Infatti, i pazienti con asma moderata hanno mostrato un miglioramento dei sintomi e un aumento significativo del volume espiratorio forzato in un secondo (FEV₁) dopo il trattamento con un antagonista selettivo CRTh2 rispetto al gruppo placebo^{8 ,9}. In uno stato più progredito della risposta infiammatoria, già reclutato le cellule T sono in grado di amplificare ulteriormente accumulazione polmonare del linfocita tramite il rilascio di IL-4 e IL-13 come potenti stimoli per DCs polmonare. Successivamente, queste cellule innate mieloide-derivato in su-regolano l’espressione di CCL17 e CCL22 in un STAT6-dipendente modo^1,10,11.  Anche se la complessità dello scenario descritto ancora ostacola una comprensione completa del polmone delle cellule T homing, offre una pletora di bersagli molecolari per un controllo terapeutico potenzialmente ottimizzato delle malattie polmonari infiammatorie o allergiche. Di conseguenza, c’è un urgente bisogno di tecniche sperimentali innovative, che sono in grado di approfondire e integrare la nostra conoscenza nel campo della cellula T chemiotassi e polmone homing ulteriormente.

Dovuto al fatto che homing polmonare dei linfociti all’interno del corpo umano è influenzata da molteplici parametri cellulari, umorale e fisica¹, la maggior parte dei metodi sperimentali esistenti non sono in grado di modellare tutta la complessità di questo processo immunologico. Invece, molti protocolli standard per l’analisi del polmone homing selettivamente concentrano su un aspetto specifico coinvolto nella cascata di attrazione del linfocita, adesione, migrazione e ritenzione. Oltre ad una determinazione puramente descrittiva del pattern di espressione di mRNA o proteina delle integrine e chemochine recettori sui linfociti periferici o polmone-infiltrazione e la misura complementare di chemokine rispettivi livelli nel sangue, il lavaggio broncoalveolare (BAL) o tessuto polmonare^12,13,14,15, saggi di cultura consolidata in vitro delle cellule consentono una caratterizzazione funzionale di adesione dei linfociti o chemiotassi al momento definito condizioni sperimentali^16,17,18. In linea di principio, saggi di adesione statica in vitro monitorare la capacità legante di linfociti coltivati per un monostrato endoteliale o diapositive di vetro rivestiti con molecole di adesione endoteliali ricombinante (ad es., MAdCAM-1, VCAM-1), mentre in vitro standard chemiotassi sono solitamente applicati al fine di quantificare la capacità dei linfociti di migrano lungo un gradiente di chemokine in un sistema di transwell¹⁹. Entrambe le impostazioni in vitro permettono una regolazione controllata e la modulazione delle condizioni sperimentali, ma d’altra parte mancano importanti variabili note criticamente l’impatto sulla chemiotassi in vivo e l’adesione dei linfociti. Principalmente, saggi di cultura statica cellulare ignorare l’influenza delle forze di taglio causate dal flusso di sangue permanente¹⁹ e potenzialmente trascurano il coinvolgimento del milieu immunologica circostante e interagenti non-linfocita cellule immunitarie, entrambi presenti in un organismo vivente. Per superare queste limitazioni, l’interpretazione dei risultati acquisiti nelle analisi in vitro statiche di chemiotassi o aderenza bisogno ulteriore convalida negli esperimenti di adesione dinamico sotto flusso condizioni^20,21 e in vivo modelli di infiammatorio organo patologia¹⁹. Infatti, importanti studi sugli animali potrebbero trarre conclusioni sulla regolamentazione del polmone delle cellule T homing in condizioni infiammatorie o allergiche analizzare geneticamente topi modificati in modelli definiti di diverse malattie polmonari^{3, 22 , 23}. il confronto quantitativo del polmone infiltrazione di linfociti tra topi selvatici e topi con un deficit per un gene specifico di interesse rappresenta uno strumento ben consolidato e largamente usato per definire l’impatto del cellulare particolare percorsi o recettori sul modello di malattia basato di distribuzione delle cellule T. Tuttavia, contrariamente a prima discusso saggi di cultura in vitro delle cellule, un disegno di studio basato su modelli animali classici manca la capacità di analizzare e monitorare le cellule T umane primarie direttamente derivate dal sangue o BAL di pazienti affetti da un infiammatorio del polmone malattia. Così, rimane ancora impegnativo per convalidare funzionalmente se una malattia polmonare diagnosticamente specificato è in grado di imprimere i linfociti umani per tropismo preferenziale del polmone e fino a che punto i parametri clinici potrebbero avere un impatto su questo scenario. Recentemente, un approccio molto elegante in vivo è stato introdotto nel contesto delle malattie infiammatorie croniche intestinali (IBD), che era in grado di superare la maggior parte di queste limitazioni e aperto nuove strade per studi avanzati traslazionali su linfociti intestinali homing²⁴ . Approfittando dei protocolli per schiarimento del tessuto solvente seguita da microscopia di fluorescenza di luce-foglio trasversale come un potente strumento di imaging, è stato possibile visualizzare l’infiltrazione e la distribuzione delle cellule T umane passivamente trasferite nell’intestino dei topi immunodeficienti colitic²⁴. In particolare, questa impostazione sperimentale implementato due innovazioni principali: (1) cellule immuni umane primarie possono essere analizzati in condizioni in vivo sperimentalmente definite; (2) una zona piuttosto grande di organo malato (circa 1,5 x 1,5 cm) può essere imaged in qualità ad alta risoluzione, seguita da ricostruzione 3D. Inoltre, parecchi studi recenti stabilito con successo l’uso del tessuto a base di solvente di compensazione e microscopia a fluorescenza di luce-foglio come strumenti importanti per polmonare avanzato imaging^25,26. Al fine di beneficiare di questo progresso tecnologico nel campo dell’immunologia polmonare, abbiamo ora adottato il sistema per analisi di homing polmonare.

Il protocollo qui presentato fornisce un’introduzione passo passo come purificare e fluorescente etichetta primaria umana T cellule per trasferimento in topi con infiammazione polmonare indotta e, inoltre, descrive in dettaglio il processo successivo di luce-foglio imaging al microscopio di fluorescenza, tra cui organo preparazione ed elaborazione di immagini. Nel complesso, ci auguriamo sostenere gli studi traslazionali futuri nel campo delle malattie polmonari infiammatorie o allergiche introducendo un sofisticato, ma modello tuttavia fattibile, sperimentale per il monitoraggio di homing polmonare del linfocita umano su condizioni in vivo.

Protocol

Esperimenti che coinvolgono gli animali sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dalle autorità locali competenti a Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Germania). Topi sono stati alloggiati in condizioni da organismi patogeni specifiche. La raccolta di sangue umano è stata approvata dal comitato etico locale e il Comitato di revisione istituzionale dell’Università di Erlangen-Norimberga. Ogni paziente ha dato il consenso informato scritto. 1. indurre infiammazione allergi…

Representative Results

Il protocollo presentato descrive un modello sperimentale del topo, che consente di monitorare e quantificare l’accumulo di linfociti T umani passivamente trasferiti nel polmone tramite microscopia a fluorescenza di luce-foglio. Figura 1 A fornisce una descrizione schematica dei passaggi del piano sperimentale in vivo. Al fine di garantire risultati affidabili, è di importanza notevole per garantire una buona qualità dell’isolato e fluorescente etichettato CD4 umana+…

Discussion

L’impostazione sperimentale descritto qui offre la possibilità di monitorare la capacità di homing polmonare delle cellule immuni umane primarie sotto condizioni infiammatorie in vivo e quindi relativo complementi classicamente eseguita la chemiotassi e l’adesione in vitro saggi. Per tener conto delle caratteristiche specifiche dell’organo anatomico del polmone, aspetti importanti della cellula immunitaria homing (compreso distribuzione chemiotassi e cella all’interno dell’organo bersaglio)…

Materials

Agarose NEEO Ultra	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	2267.4
AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody	BioLegend, San Diego, USA	304060
Ammonium chloride	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	K2981
Cannula 21 G	Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA	301300
Cell proliferation dye eflour670	eBioscience Inc., San Diego, USA	65-0840-85
CD4 MicroBeads, human	Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany	130-045-101
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	8043.1
Potassium-EDTA blood collection tube, 9 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	21066001
Ethly cinnamate (ECi)	Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany	112372-100G
Ethanol ≥ 99.5 % (EtOH)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	5054.3
FBS (fetal bovine serum) Good Forte	PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany	P40-47500
Filter 100 µm	VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany	732-2758
Imaris Image Analysis Software 9.0.2	Bitplane AG, Zurich, Switzerland	n.a.
ImspectorPro software	Abberior Instruments GmbH, Göttingen, Germany	n.a.
Ketamin	Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany	3617KET-V
LaVision UltraMicroscope II	LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany	n.a.
MACS MultiStand	Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany	130-042-303
Multifly cannula 20 G	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	851638035
30 G needle	B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany	9161502
Neubauer counting chamber	neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	C-1003
Pattex Glue	Henkel AG & Co, Düsseldorf, Germany	PSK1C
LS column	Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany	130-042-401
Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/ml)	anprotec	AC-AF-0018
RPMI medium	(Gibco) Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany	61870-010
Papain	Merck	1,071,440,025
PBS Dulbecco (phosphate buffered saline)	Biochrom GmbH, Berlin, Germany	L182-10
PerCP/Cy5.5 anti-human CD4	BioLegend, San Diego, USA	317428
PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, κ isotype Ctrl	BioLegend, San Diego, USA	400337
PFA (paraformaldehyde)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	0335.1
Potassium hydrogen carbonate	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	P7481
Serological pipette 10 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	86.1254.001
Syringe 1 ml	B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany	9166017V
Syringe 5 ml	Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA	260067
Syringe 20 ml	Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA	260069
Tube 1.5 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	72,706,400
Tube 2 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	72.695.400
Tube 2 ml, brown	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	72,695,001
Tube 15 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	62.554.502
Tube 50 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	62.547.254
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany	130-090-976
Xylazin (Rompun 2%)	Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany	KPOBD32