يسمح البروتوكول أدخل هنا وصف قدرة الرئة صاروخ موجه من الخلايا الليمفاوية البشرية الأولية المجراة في ظروف التحريضية. تسلل الرئوية أدوبتيفيلي نقل الخلايا المناعية البشرية في نموذج ماوس للالتهاب التحسسي يمكن تصويرها وكمياً بالفحص المجهري الفلورية الضوء-ورقة من أنسجة الرئة المطهرة كيميائيا.
الساحقة تراكم الأنسجة للغاية تنشيط الخلايا المناعية يمثل سمة مميزة لمختلف الأمراض المزمنة التحريضية، وبرزت بوصفها هدفا جذاباً علاجية في المعالجة السريرية للمرضى المتضررين. من أجل مواصلة تحسين استراتيجيات تهدف إلى تنظيم العلاجية من تسلل الخلايا المناعية برو-التهابات أنسجة مرضية غير متوازن، ستكون ذات أهمية خاصة لتحقيق رؤى تحسن في حدة المرض والجهاز صاروخ موجه خصائص الخلايا اللمفية الطرفية. يسمح البروتوكول التجريبي المبين هنا لرصد تراكم الرئة من الخلايا الليمفاوية البشرية المسماة فلوريسسينتلي ونقلت أدوبتيفيلي في سياق التهاب الرئوي الناجم عن غراء. وعلى النقيض من فحوصات في المختبر القياسية استخداماً لتحليل الهجرة الخلية المناعية وانزيمية، الإعداد المجراة في أدخلت الآن يأخذ في الحسبان الجوانب الخاصة بالرئة من الأنسجة المنظمة وتأثير المجمع التحريضية السيناريو تجري في الحي مورين. وعلاوة على ذلك، التصوير المجهري الفلورية الضوء-ورقة مقطعية ثلاثية الأبعاد لا توفر البيانات الكمية فقط على التسلل إلى الخلايا المناعية، ولكن أيضا يصور نمط الخلية المناعية التعريب داخل الرئة الملتهبة. وعموما، نحن قادرون على الأخذ تقنيات مبتكرة ذات قيمة عالية للبحوث المناعية في مجال الأمراض المزمنة التهاب الرئة، والتي يمكن تطبيقها بسهولة باتباع البروتوكول خطوة بخطوة المتوفرة.
الكلاسيكية اضطرابات التهاب في الرئة، مثل حساسية الربو ومرض انسداد الشعب الهوائية المزمن (COPD)، معروفة جيدا يكون مدفوعا توظيف المتزايد لتنشيط الخلايا الليمفاوية في أنسجة الرئة1،2. صدر اللمفاويات السيتوكينات (مثلاً، وايل-4، وايل-5، 9 إيل، إيل-13، IFN-γ وتنف-α) مواصلة تعزيز إنزيمية للخلايا المناعية الفطرية وقابلة للتكيف، والحث على إعادة عرض مجرى الهواء تليفية أو أضرار مباشرة في لحمه الرئة2. وحتى الآن، الآليات الأساسية المسؤولة عن تراكم المرضية للخلايا الليمفاوية داخل أنسجة الرئة لا بعد فهم فهما كاملا. قياسا إلى الطباعة النسيج انتقائية تي خلية وصفت لصاروخ موجه القناة الهضمية والجلد، الخلايا الجذعية الرئوية (DCs) قادرة ومن الواضح أن رئيس الوزراء خلايا تي الطرفية لتسلل الرئة تفضيلية، على الأقل جزئيا عن طريق تنظيم دورات تعريفية للتعبير CCR4 على سطح الخلايا الليمفاوية3. بالإضافة إلى CCR4، وخلايا تي التسلل إلى مجرى الهواء تتميز أيضا بتعبير لا سيما زيادة مستقبلات chemokine CCR5 و CXCR3 بالمقارنة مع خلايا T داخل الدم الطرفية1،،من45. البيانات الشاملة، القائمة تتسق مع مفهوم أن صاروخ موجه الرئة من الخلايا اللمفية تي تحت ظروف فسيولوجية أو تحريضية ينطوي على عدد من مستقبلات تشيموكيني مختلفة وعلى يغاندس كل منهما وهكذا حاسمة يتوقف على عن كثب التحكم في التعاون بين الخلايا المناعية الفطرية والتكيف1. خصوصا، خلال المرحلة الأولى من التعرض للعوامل الممرضة أو المسببة للحساسية، خلايا نظام المناعة الفطرية الاستجابة للتحفيز TLR أو لفريق الخبراء الحكومي الدولي بوساطة العابرة للربط بالإفراج الفوري عن تشيمواتراكتانتس المختلفة، مثل لتب4، CCL1، CCL17، CCL22، CCL20، CXCL10، و PGD21،،من67. كمثال، التفاعل بين PGD2 ومستقبلات تشيمواتراكتانت CRTh2 ومن المعروف أن تكون ذات أهمية خاصة بالنسبة إنزيمية خلايا Th2 وهكذا يبدو الهدف العلاجي كما تبشر بالخير في الإدارة السريرية للربو. وفي الواقع، مرضى الربو المعتدل أظهرت تحسنا في الأعراض وزيادة كبيرة في حجم الزفير القسري في ثانية واحدة (FEV1) بعد العلاج مع خصم CRTh2 انتقائية مقارنة مع مجموعة الغفل8 ،9. في حالة أكثر تقدما من الاستجابة الالتهابية، خلايا تي المعينين أصلاً قادرة على تضخيم زيادة تراكم اللمفاويات الرئوي عن طريق الإفراج عن إيل-4، وايل-13 كمحفزات قوية لوحدات تحكم المجال Dc الرئوية. في وقت لاحق، هذه الخلايا الفطرية النقوي المشتقة يصل-تنظيم التعبير عن CCL17 و CCL22 في STAT6-تعتمد على طريقة1،،من1011. على الرغم من أن الطابع المعقد للسيناريو الذي وصف لا يزال يعوق فهم كامل للرئة الخلية تي صاروخ موجه، ويقدم مجموعة كبيرة أهداف الجزيئية لعنصر تحكم علاجية المحتملة أمثل لأمراض الجهاز التنفسي التهابات أو حساسية. ولذلك، هناك حاجة ملحة للتقنيات التجريبية المبتكرة، التي قادرة على تعميق وتكمل معرفتنا في مجال إنزيمية خلية تي والرئة صاروخ موجه.
يرجع ذلك إلى حقيقة أن صاروخ موجه الرئة من الخلايا الليمفاوية داخل جسم الإنسان يتأثر ب معلمات الخلوية وخلطيه ومادية متعددة1، معظم الأساليب التجريبية الحالية ليست قادرة على نموذج كامل مدى تعقيد هذه العملية المناعية. بدلاً من ذلك، يركز العديد من البروتوكولات القياسية لتحليل الرئة صاروخ موجه بشكل انتقائي على جانب محدد تشارك في سلسلة من جاذبية اللمفاويات والالتصاق، والهجرة والاحتفاظ بها. وإلى جانب تحديد وصفية بحتة لنمط التعبير مرناً أو البروتين مستقبلات إينتيجرينس وتشيموكيني في الخلايا اللمفية الطرفية أو التسلل إلى الرئة وقياس مستويات كل منها تشيموكيني في الدم، مكملة للفيسيولوجيا الغسل (بال) أو أنسجة الرئة12،13،،من1415، ثقافة راسخة الخلايا في المختبر فحوصات السماح لتوصيف وظيفي لالتصاق الخلايا اللمفاوية أو إنزيمية عند تعريف الظروف التجريبية16،،من1718. من حيث المبدأ، رصد فحوصات التصاق في الأنابيب ثابت قدرة الربط لمفاوية مثقف لأحادي الطبقة غشائي أو شرائح زجاجية مغطاة بجزيئات الالتصاق غشائي المؤتلف (مثلاً، مادكام-1، VCAM-1)، بينما المعيار في المختبر عادة ما يتم تطبيق فحوصات إنزيمية من أجل قياس قدرة الخلايا الليمفاوية ترحيل على طول تدرج تشيموكيني في نظام ترانسويل19. كلا الإعدادات في المختبر تمكن من التكيف التي تسيطر عليها والتحوير للظروف التجريبية، ولكن من ناحية أخرى تفتقر إلى متغيرات هامة تعرف بالغة الأثر على إنزيمية في الحية والتصاق الخلايا الليمفاوية. يغلب عليها الطابع، تجاهل تأثير قوي القص الناتجة عن تدفق الدم الدائمة19 فحوصات الثقافة الخلية ثابت ويحتمل أن إهمال مشاركة الوسط المناعية المحيطة والمتفاعلة الخلايا المناعية غير اللمفاويات، كل هذا في حي. وللتغلب على هذه القيود، تفسير النتائج المكتسبة في ثابتة في المختبر فحوصات إنزيمية أو الانضمام تحتاج إلى مزيد من التحقق من الصحة في تجارب التصاق الحيوية تحت ظروف تدفق20،21 وفي فيفو نماذج من أمراض التهابات الجهاز19. في الواقع، يمكن استخلاص استنتاجات بشأن تنظيم الرئة الخلية تي صاروخ موجه تحت ظروف التهابات أو حساسية من الدراسات الحيوانية الهامة تحليل وراثيا تعديل الفئران في نماذج محددة لمختلف الأمراض الرئوية3، 22 , 23-مقارنة كمية من التسلل إلى الخلايا الليمفاوية بين wildtype الفئران والفئران مع نقص جين معين من الفائدة يمثل أداة راسخة والمستخدمة على نطاق واسع لتحديد أثر الخلوية خاصة الرئة المسارات أو مستقبلات على نمط توزيع T خلية يحركها المرض. ومع ذلك، خلافا لقبل مناقشة الثقافة الخلايا في المختبر فحوصات، تصميم دراسة استناداً إلى نماذج حيوانية الكلاسيكية يفتقر إلى القدرة على تحليل ورصد خلايا تي البشرية الأولية المستمدة مباشرة من الدم أو بال للمرضى الذين يعانون من التهابات الرئة المرض. وهكذا، فإنه لا يزال تحديا وظيفيا التحقق من صحة ما إذا كان مرض الرئة دياجنوستيكالي محدد قادرة على بصمة الخلايا الليمفاوية البشرية انتحاء الرئة تفضيلية ومدى المعلمات السريرية قد يؤثر على هذا السيناريو. ومؤخرا، تم إدخال نهج المجراة في أنيقة جداً في سياق أمراض التهاب الأمعاء (بنك التنمية بين الأمريكتين)، التي تمكنت من التغلب على معظم هذه القيود وفتح آفاقاً جديدة لدراسات متقدمة متعدية الجنسيات في اللمفاويات المعوية صاروخ موجه24 . الاستفادة من البروتوكولات لإزالة النسيج المستندة إلى المذيبات تليها مجهرية مستعرضة ورقة الضوء الفلورية كأداة قوية لتصوير، كان من الممكن تصور تسلل وتوزيع الخلايا البشرية المنقولة أدوبتيفيلي في الأمعاء من الفئران العوز كوليتيك24. على وجه الخصوص، تطبيق هذا الإعداد التجريبية اثنان من الابتكارات الرئيسية: يمكن تحليل الخلايا المناعية البشرية الأولية (1) تحت ظروف المجراة في تجريبيا محددة؛ (2) منطقة كبيرة بدلاً من الجهاز المريضة (حوالي 1.5 × 1.5 سم) يمكن تصويرها بجودة عالية الدقة، تليها 3D-التعمير. وعلاوة على ذلك، العديد من الدراسات الأخيرة نجحت في إنشاء استخدام النسيج المستندة إلى المذيبات المقاصة والأسفار الضوء-ورقة الفحص المجهري كأدوات هامة للرئة المتقدمة التصوير،من2526. من أجل الاستفادة من هذا التقدم التكنولوجي في مجال علم المناعة الرئوية، ونحن الآن اعتمد النظام لتحليل الرئة صاروخ موجه.
يوفر البروتوكول المعروضة هنا مقدمة خطوة بخطوة كيفية تنقية والتسمية تي البشرية الأولية الخلايا لنقل في الفئران مع التهاب رئوي المستحث، وعلاوة على ذلك، يصف بالتفصيل عملية لاحقة للضوء–ورقة فلوريسسينتلي التصوير المجهري الأسفار، بما في ذلك إعداد الجهاز ومعالجة الصور. وعموما، نأمل لدعم الدراسات متعدية الجنسيات في المستقبل في مجال أمراض الرئة التهابات أو حساسية بإدخال متطورة، لكن نموذج مجدية، والتجريبية لرصد صاروخ موجه الرئة اللمفاويات البشرية بناء على ظروف المجراة.
الإعداد التجريبية الموصوفة هنا يوفر الفرصة لرصد قدرة الرئة صاروخ موجه من الخلايا المناعية البشرية الأولية المجراة في ظروف التحريضية، ومما الناقوس يكمل كلاسيكي التصاق في الأنابيب وانزيمية فحوصات. على أن تراعي الهيئة التشريحية محددة الخصائص في الرئة، جوانب هامة من الخلاي?…
The authors have nothing to disclose.
امتنان يعترف الكتاب تمويل مراكز البحوث التعاونية DFG SFB 1181 و 241 تر. بصري تصوير المركز ارلنجن (OICE) وخاصة رالف بالميسانو وفيليب Tripal وتينا Fraaß (Z2 المشروع من DFG CRC 1181) معترف بها لخبراء الدعم الفني للتصوير المجهري fluorescence الورقة الضوء.
Agarose NEEO Ultra | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 2267.4 | |
AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody | BioLegend, San Diego, USA | 304060 | |
Ammonium chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | K2981 | |
Cannula 21 G | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 301300 | |
Cell proliferation dye eflour670 | eBioscience Inc., San Diego, USA | 65-0840-85 | |
CD4 MicroBeads, human | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-045-101 | |
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 8043.1 | |
Potassium-EDTA blood collection tube, 9 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 21066001 | |
Ethly cinnamate (ECi) | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | 112372-100G | |
Ethanol ≥ 99.5 % (EtOH) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 5054.3 | |
FBS (fetal bovine serum) Good Forte | PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany | P40-47500 | |
Filter 100 µm | VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany | 732-2758 | |
Imaris Image Analysis Software 9.0.2 | Bitplane AG, Zurich, Switzerland | n.a. | |
ImspectorPro software | Abberior Instruments GmbH, Göttingen, Germany | n.a. | |
Ketamin | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany | 3617KET-V | |
LaVision UltraMicroscope II | LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany | n.a. | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-042-303 | |
Multifly cannula 20 G | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 851638035 | |
30 G needle | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany | 9161502 | |
Neubauer counting chamber | neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany | C-1003 | |
Pattex Glue | Henkel AG & Co, Düsseldorf, Germany | PSK1C | |
LS column | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/ml) | anprotec | AC-AF-0018 | |
RPMI medium | (Gibco) Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
Papain | Merck | 1,071,440,025 | |
PBS Dulbecco (phosphate buffered saline) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | L182-10 | |
PerCP/Cy5.5 anti-human CD4 | BioLegend, San Diego, USA | 317428 | |
PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, κ isotype Ctrl | BioLegend, San Diego, USA | 400337 | |
PFA (paraformaldehyde) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 0335.1 | |
Potassium hydrogen carbonate | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | P7481 | |
Serological pipette 10 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 86.1254.001 | |
Syringe 1 ml | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany | 9166017V | |
Syringe 5 ml | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 260067 | |
Syringe 20 ml | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 260069 | |
Tube 1.5 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72,706,400 | |
Tube 2 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72.695.400 | |
Tube 2 ml, brown | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72,695,001 | |
Tube 15 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62.554.502 | |
Tube 50 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62.547.254 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-090-976 | |
Xylazin (Rompun 2%) | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | KPOBD32 |