Construction et utilisation d’une chambre de Stimulation électrique pour renforcer la différenciation ostéogénique dans les cellules souches mésenchymateuses/stromales In Vitro
Summary
Nous présentons ici un protocole pour la construction d’une chambre de culture cellulaire conçue pour exposer les cellules de différents types de stimulation électrique et son utilisation dans le traitement des cellules souches mésenchymateuses afin d’améliorer la différenciation ostéogénique.
Abstract
Cellules souches/stromales mésenchymateuses (CSM) ont été largement utilisés pour promouvoir la guérison osseuse dans les approches en génie tissulaire. Stimulation électrique (EStim) a été démontrée pour augmenter la différenciation ostéogénique MSC in vitro et promouvoir OS guérison en milieu clinique. Nous décrivons ici la construction d’une chambre de culture de cellules EStim et son utilisation dans le traitement de rat MSC OS-moelle osseuse afin d’améliorer la différenciation ostéogénique. Nous avons constaté que traitant MSCs avec EStim pendant 7 jours se traduit par une augmentation significative de la différenciation ostéogénique, et surtout, cet effet pro-ostéogénique persiste longtemps après que (7 jours) EStim est discontinué. Cette approche de pré-traitement MSCs avec EStim afin d’améliorer la différenciation ostéogénique pourrait être utilisée pour optimiser le tissu osseux, ingénierie des résultats du traitement et, ainsi, les aider à réaliser leur potentiel thérapeutique complet. En plus de cette application, cette chambre de culture de cellules EStim et protocole permet également d’enquêter sur d’autres comportements de cellule EStim sensibles, tels que de la migration, prolifération, apoptose et fixation de l’échafaudage.
Introduction
Une augmentation des traumatismes et/ou défauts osseux induite par la maladie sont traitées à l’aide de différentes combinaisons de thérapie cellulaire et les technologies de la médecine régénérative. MSCs sont la cellule de choix dans ces traitements, en raison de leur activité ostéogénique relativement élevée, isolement et expansion efficacité et sécurité1. Pour optimiser leur activité ostéogénique et, par conséquent, optimiser leur efficacité thérapeutique, plusieurs méthodes ont été introduites pour manipuler les MSCs avant leur utilisation dans ces traitements (tel qu’il est examiné par Mauney Al.2). Une de ces méthodes est EStim, qui a été montré pour améliorer la différenciation ostéogénique MSC in vitro3 et promouvoir OS in vivo4de guérison. Malgré le nombre croissant d’études qui portent sur le traitement de MSCs avec EStim, un régime optimal pour maximiser l’effet pro-ostéogénique de EStim doit encore être défini.
Autres méthodes in vitro à l’aide d’EStim utilisent des ponts salins immergés dans le milieu de culture, qui sépare les cellules des électrodes métalliques5. L’avantage de ceci est que livraison estimée par l’intermédiaire de ponts salins élimine l’introduction de sous-produits chimiques (p. ex., la corrosion des électrodes métalliques) qui peuvent être cytotoxiques. Malgré cet avantage, ponts salins sont difficiles à travailler avec, et l’EStim ils livrent diffère de celui livré en modèles in vivo, compliquant la corrélation entre les résultats obtenus en utilisant les deux systèmes. Configurations qui offrent EStim via des électrodes métalliques ou de carbone fixés à l’intérieur des puits de culture cellulaire (tel que revu par Hronik-Tupaj et Kaplan6) mieux simulent appareils utilisés in vivo ; Cependant, ces dispositifs sont difficiles à nettoyer/stériliser entre chaque utilisation et le nombre de cellules qui peuvent être étudiés par l’expérience est limité. Nous avons conçu la chambre EStim présentée ici spécifiquement pour pallier les lacunes de ces autres configurations. Alors que la majeure partie de notre expérience dans l’utilisation de cette chambre EStim travaille chez 2D et 3D cultures contenant de la moelle osseuse et adipeux tissu-dérivés – MSCs3,4, est un avantage majeur de cette chambre, qui il est polyvalent et, avec relativement mineur changements, peut être adapté pour étudier d’autres types de cellules dans une variété de différentes conditions.
Nous décrivons ici la construction d’une chambre de culture de cellules EStim ; Ensuite, nous montrons l’utilisation de MSCs traitants avec différents schémas d’EStim et mesurant l’effet qui en résulte sur la différenciation ostéogénique. Différenciation ostéogénique MSC est évaluée par le dépôt de calcium, l’activité phosphatase alcaline et expression du gène marqueur ostéogénique. Ce qui est important, dans passé des expériences qui ont utilisé cette configuration, nous avons observé que ces effets pro-ostéogénique persistent longtemps après que le traitement EStim a été interrompu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici la construction d’une chambre et une méthode pour le traitement des cellules souches mésenchymateuses EStim qui entraîne une différenciation ostéogénique.
L’installation d’EStim présentée ne nécessite pas d’équipement/connaissances particulières et peut être effectuée dans un laboratoire de biologie/biochimie des cellules souches standard de chercheurs débutants. Toutefois, lorsque la construction et à l’aide de la chambre EStim, spécial il faut en…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par une subvention de démarrage de la Fondation AO (S-14-03 H) et la fondation de Friedrichsheim (Stiftung Friedrichsheim) basé à Francfort/Main, Allemagne.
Materials
| Estim fabrication | |||
| Banana connector/Jack adaptor | Poppstars | 1008554 | 2 pieces |
| Cutting pliers | Knipex | 78 03 125 | |
| DC power supply (0-30V/0-3A) | B&K Precision | Model 9130B | Any simular model could be used |
| Insulated flexible wires (0.14 mm2) | Conrad Electronic International | 604794, 604093 | 2 pieces |
| Non-corrosive silicone rubber | Dow Corning | 3140 RTV | *could be purchased by many stores |
| Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø) | Junker Edelmetalle | 00D-3010 | 0.6 m needed for 1 Estim chamber |
| 70% Ethanol solution | any | Sterilisation of Estim chamber | |
| Silver coated copper wire (0.6 mm ø) | Conrad Electronic International | 409334 – 62 | ≈70 cm needed for 1 Estim device |
| Soldering iron Set | Conrad Electronic International | 1611410 – 62 | Any simular model could be used |
| TPP 6-well plate lid | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | 2 lids for Estim chamber |
| 2.2V wired circular LEDs | Conrad Electronic International | 599525 – 62 | 6 pieces |
| UHU Super glue | UHU GmbH & Co. KG | n/a | *could be purchased by many stores |
| MSC culture | |||
| β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | osteogenic cell culture |
| DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo-Fischer Scientific | 21885025 | cell culture |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo-Fischer Scientific | 14190144 | cell culture |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | osteogenic cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo-Fischer Scientific | 10500064 | cell culture |
| 50 ml Falcon tube | Sarstedt | 62,547,004 | cell culture |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | osteogenic cell culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer Scientific | 15140122 | cell culture |
| Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin | Cyagen | RASMX-01001 | cell culture |
| Cell detachment solution | Thermo-Fischer Scientific | A1110501 | cell culture, cell detachment |
| TC Flask, T75 | Sarstedt | 833911302 | cell culture |
| TPP 6-well plates | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | cell culture |
| Trypan Blue Dye, 0.4% solution | Bio-Rad | 1450021 | cell count |
Referencias
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