İnşaat ve in Vitro mezenkimal kök/Stromal hücrelerdeki Osteojenik farklılaşma güçlendirmeye yönelik bir elektriksel stimülasyon odası kullanımı
Summary
Burada çeşitli elektriksel stimülasyon ve Osteojenik farklılaşma geliştirmek için mezenkimal kök hücre tedavisinde kullanımı yapan hücreleri göstermek için tasarlanmış bir hücre kültürü odası yapımı için bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Mezenkimal kök/stromal hücreler (MSCs) kapsamlı yaklaşımlar mühendislik dokusunda kemik iyileşmesine katkıda bulunmak üzere kullanılmaktadır. Elektriksel stimülasyon (EStim) kemik klinik ayarlarında şifa teşvik ve MSC Osteojenik farklılaşma tüp bebek artırmak için gösterilmiştir. Burada biz bir EStim hücre kültürü odası İnşaatı tarif ve tedavisinde kullanımı sıçan kemik iliği türevi MSC Osteojenik farklılaşma geliştirmek için. MSCs EStim ile 7 gün süreyle tedavi Osteojenik farklılaşma önemli bir artış sonuçlanır ve önemlisi, uzun (7 gün) EStim kesilir sonra bu pro osteojenik etkisi devam ederse bulduk. Bu yaklaşım ile EStim Osteojenik farklılaşma geliştirmek için MSCs pretreating, tedavi sonuçları mühendislik kemik dokusu optimize etmek ve böylece, onlara tam terapötik potansiyellerini elde etmenize yardımcı için kullanılabilir. Bu uygulamanın yanı sıra, bu EStim hücre kültürü odası ve iletişim kuralı da geçiş, nükleer silahların yayılmasına karşı apoptozis ve iskele eki gibi diğer EStim duyarlı hücre davranışlar araştırmak için kullanılabilir.
Introduction
Travma ve/veya hastalık kaynaklı kemik defektleri artış hücre tedavisi ve rejeneratif tıp teknolojileri farklı kombinasyonları kullanarak tedavi. MSCs onların nispeten yüksek osteojenik etkinlik, yalıtım ve genişleme verimlilik ve güvenlik1nedeniyle bu tür tedavi seçiminde hücreyiz. Osteojenik faaliyetlerini en üst düzeye çıkarmak ve böylece, tedavi edici etkinliği onların en iyi duruma getirmek için çeşitli Yöntemler (Mauney ve ark.2tarafından gözden olarak) önce bu tedaviler kullanımları MSCs işlemek için getirilmiştir. Bir tür vitro3 MSC Osteojenik farklılaşma geliştirmek ve kemik içinde vivo4şifa teşvik için gösterilen EStim yöntemdir. MSCs EStim ile tedavi üzerinde odaklanan çalışmalar giderek artan sayıda rağmen EStim’ın pro osteojenik etkisi maksimize etmek için en uygun bir rejimi henüz tanımlanması gerekir.
EStim kullanarak diğer tüp bebek yöntemleri tuz köprüleri hücreleri metalik elektrotlar5‘ ten ayıran kültür orta sular altında kullanmak. Bunun yararı EStim tuz köprüler teslim sitotoksik olabilir kimyasal yan (Örneğin, korozyon metalik elektrot) getirilmesi ortadan kaldırır olduğunu. Bu avantaj rağmen tuz köprüleri ile çalışmak için hantal ve dağıttıkları EStim iki sistem kullanırken elde edilen sonuçlar ilişkilendirmek üzere o içinde teslim edilen içinde vivo modellerden farklıdır. Hücre kültür kuyu içinde sabit metalik veya karbon elektrotlar ile EStim teslim kurulumları (Hronik-Tupaj ve Kaplan6tarafından gözden olarak) daha iyi vivo içinde kullanılan aygıtlar simülasyonu; Ancak, bu cihazların temiz/kullanır arasında sterilize etmek zor ve deney okudu hücre sayısı sınırlıdır. Burada özellikle bu diğer ayarlar sınırlamaları gidermek için sunulan EStim odası dizayn ettik. Çoğu bu EStim odası kullanarak deneyimi ile 2D ve 3D kültürler, kemik iliği ve yağ-doku-kaynaklı MSCs3,4içeren bir önemli yararı bu odası bu iken bu çok yönlü ve, nispeten küçük değişiklikleri, diğer hücre tipleri farklı koşullarda çeşitli altında çalışmaya adapte olabilir.
Burada biz bir EStim hücre kültürü odası İnşaatı tarif; o zaman, biz kullanımı EStim ve Osteojenik farklılaşma ortaya çıkan etkisini ölçme farklı rejimleri ile tedavi MSCs tarafından göstermek. MSC Osteojenik farklılaşma kalsiyum birikimi, alkalen fosfataz aktivitesi ve osteojenik marker gen ekspresyonu ile değerlendirilir. Önemlisi, bu kurulum programı, kullanılan deneyler biz uzun EStim tedavi kesildi sonra bu pro osteojenik efektleri geçerli gözlenen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada bir odası ve gelişmiş Osteojenik farklılaşma sonuçları EStim ile mezenkimal kök hücre tedavisi için bir yöntem açıklanmaktadır.
Sunulan EStim Kur özel ekipman/bilgi gerektirmez ve bir standart kök hücre biyolojisi/Biyokimya laboratuarında genç araştırmacılar tarafından gerçekleştirilebilir. Ancak, ne zaman bina ve EStim odası kullanarak, kritik bir kaç adımda özel bakım alınmalıdır. Bu metal çok yumuşak ve hassas olduğu gibi platin elektrotlar işlerk…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser kısmen bir AO Vakfı Start-Up hibe (S-14-03 H) ve Friedrichsheim Frankfurt am Main, Almanya tabanlı Vakfı (Stiftung Friedrichsheim) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Estim fabrication | |||
| Banana connector/Jack adaptor | Poppstars | 1008554 | 2 pieces |
| Cutting pliers | Knipex | 78 03 125 | |
| DC power supply (0-30V/0-3A) | B&K Precision | Model 9130B | Any simular model could be used |
| Insulated flexible wires (0.14 mm2) | Conrad Electronic International | 604794, 604093 | 2 pieces |
| Non-corrosive silicone rubber | Dow Corning | 3140 RTV | *could be purchased by many stores |
| Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø) | Junker Edelmetalle | 00D-3010 | 0.6 m needed for 1 Estim chamber |
| 70% Ethanol solution | any | Sterilisation of Estim chamber | |
| Silver coated copper wire (0.6 mm ø) | Conrad Electronic International | 409334 – 62 | ≈70 cm needed for 1 Estim device |
| Soldering iron Set | Conrad Electronic International | 1611410 – 62 | Any simular model could be used |
| TPP 6-well plate lid | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | 2 lids for Estim chamber |
| 2.2V wired circular LEDs | Conrad Electronic International | 599525 – 62 | 6 pieces |
| UHU Super glue | UHU GmbH & Co. KG | n/a | *could be purchased by many stores |
| MSC culture | |||
| β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | osteogenic cell culture |
| DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo-Fischer Scientific | 21885025 | cell culture |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo-Fischer Scientific | 14190144 | cell culture |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | osteogenic cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo-Fischer Scientific | 10500064 | cell culture |
| 50 ml Falcon tube | Sarstedt | 62,547,004 | cell culture |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | osteogenic cell culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer Scientific | 15140122 | cell culture |
| Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin | Cyagen | RASMX-01001 | cell culture |
| Cell detachment solution | Thermo-Fischer Scientific | A1110501 | cell culture, cell detachment |
| TC Flask, T75 | Sarstedt | 833911302 | cell culture |
| TPP 6-well plates | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | cell culture |
| Trypan Blue Dye, 0.4% solution | Bio-Rad | 1450021 | cell count |
Referencias
- Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence?. Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).
- Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects. Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).
- Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells. PeerJ. 5, e2821 (2017).
- Leppik, L., et al. Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model. Scientific Reports. 8 (1), S1 (2018).
- Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nature Protocols. 2 (6), 1479-1489 (2007).
- Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).
- Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Journal of Orthopaedic Translation. 3 (1), 26-33 (2015).
- Nau, C., et al. Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats. International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).
- Eischen-Loges, M., Oliveira, K. M. C., Bhavsar, M. B., Barker, J. H., Leppik, L. Pretreating mesenchymal stem cells with electrical stimulation causes sustained long-lasting pro-osteogenic effects. PeerJ. 6, 4959 (2018).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Curtis, K. M., et al. EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells. BMC Molecular Biology. 11, 61 (2010).
- Wang, L., Li, Z. -. y., Wang, Y. -. p., Wu, Z. -. h., Yu, B. Dynamic Expression Profiles of Marker Genes in Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells. Chinese Medical Sciences Journal (Chung-kuo i hsueh k’o hsueh tsa chih). 30 (2), 108-113 (2015).
- Kim, H. B., Ahn, S., Jang, H. J., Sim, S. B., Kim, K. W. Evaluation of corrosion behaviors and surface profiles of platinum-coated electrodes by electrochemistry and complementary microscopy: biomedical implications for anticancer therapy. Micron. 38 (7), 747-753 (2007).
- Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. , mbcE18010077 (2018).
- Tai, G., Tai, M., Zhao, M. Electrically stimulated cell migration and its contribution to wound healing. Burns & Trauma. 6, 20 (2018).
- Love, M. R., Palee, S., Chattipakorn, S. C., Chattipakorn, N. Effects of electrical stimulation on cell proliferation and apoptosis. Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1860-1876 (2018).
- Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 385-397 (2012).
- Jin, G., Li, K. The electrically conductive scaffold as the skeleton of stem cell niche in regenerative medicine. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 45, 671-681 (2014).
- Hronik-Tupaj, M., Rice, W. L., Cronin-Golomb, M., Kaplan, D. L., Georgakoudi, I. Osteoblastic differentiation and stress response of human mesenchymal stem cells exposed to alternating current electric fields. Biomedical Engineering Online. 10, 9 (2011).
