Construcción y uso de una cámara de estimulación eléctrica para mejorar la diferenciación osteogénica de células madre mesenquimales, estromales In Vitro
Summary
Aquí presentamos un protocolo para la construcción de una cámara de cultivo celular diseñada para exponer distintos tipos de estimulación eléctrica y su uso en el tratamiento de células madre mesenquimales para realzar la diferenciación osteogénica de las células.
Abstract
Células madre/estromales mesenquimales (MSCs) se han utilizado extensivamente para promover el hueso curativo en enfoques de ingeniería de tejidos. Estimulación eléctrica (EStim) se ha demostrado para aumentar la diferenciación osteogénica de MSC in vitro y promover hueso curativo en ajustes clínicos. Aquí describimos la construcción de una cámara de cultivo celular de EStim y su uso en el tratamiento de MSC de médula ósea para mejorar la diferenciación osteogénica de la rata. Se encontró que el tratamiento de MSCs con EStim durante 7 días da lugar a un aumento significativo en la diferenciación osteogénica, y lo importante, este efecto osteogénico pro persiste mucho tiempo después (7 días) EStim. Este enfoque de pretratamiento de MSCs con EStim para mejorar la diferenciación osteogénica podría utilizarse para optimizar los resultados del tratamiento de recreando el tejido del hueso y, así, ayudarles a alcanzar su potencial completo terapéutico. Además de esta aplicación, esta EStim compartimiento de la cultura de célula y protocolo pueden también utilizar para investigar otros comportamientos de célula EStim-sensibles, tales como la migración, proliferación, apoptosis y accesorio del andamio.
Introduction
Un aumento de traumas o defectos óseos inducidos por la enfermedad son tratados con diferentes combinaciones de tecnologías de la medicina regenerativa y terapia celular. MSCs son la célula de elección en estos tratamientos, debido a su relativamente alta actividad osteogénica, aislamiento y eficiencia de expansión y seguridad1. Para maximizar su actividad osteogénica y, así, optimizar su eficacia terapéutica, se han introducido varios métodos para manipular MSCs antes de su uso en estos tratamientos (ya revisado por Mauney et al.2). Un tal método es EStim, que se ha demostrado para mejorar la diferenciación osteogénica de MSC en vitro3 y promover hueso curativo en vivo4. A pesar del creciente número de estudios centrados en el tratamiento de MSCs con EStim, un régimen óptimo para maximizar el efecto pro-osteogénica de EStim todavía tiene que definirse.
Otros métodos in vitro utilizando EStim utilizan puentes de sal sumergidos en el medio de cultivo, que separa las células de electrodos metálicos5. La ventaja es que entrega EStim a través de puentes de sal elimina la introducción de subproductos químicos (por ejemplo, corrosión de los electrodos metálicos) que pueden ser citotóxicos. A pesar de esta ventaja, puentes de sal son engorrosos para trabajar con, y EStim que difiere de la que en los modelos in vivo, lo que es difícil correlacionar los resultados obtenidos al utilizar los dos sistemas. Configuraciones que EStim vía los electrodos metálicos o carbono fijados dentro de los pozos de la cultura de célula (ya revisado por Tupaj Hronik y Kaplan6) simulan mejor los dispositivos usados en vivo; sin embargo, estos dispositivos son difíciles de limpiar/esterilizar entre los usos y el número de células que pueden ser estudiados por experimento está limitado. Diseñamos la cámara EStim presentada específicamente para hacer frente a las limitaciones de estas otras configuraciones. Aunque la mayor parte de nuestra experiencia con esta cámara EStim ha sido con 2D y 3D culturas que contiene médula ósea adiposo-tejido-derivadas y MSCs3,4, una gran ventaja de esta cámara es es versátil y, con relativamente menores cambios, pueden ser adaptados a otros tipos celulares bajo una variedad de diferentes condiciones de estudio.
Aquí describimos la construcción de una sala de cultura de célula EStim; Luego, se demuestra su uso por MSCs tratando con diferentes regímenes de EStim y medir el efecto resultante sobre la diferenciación osteogénica. Diferenciación osteogénica MSC es evaluada a través de la deposición de calcio, actividad de la fosfatasa alcalina y expresión génica de marcadores osteogénicos. Lo importante, más allá de experimentos que utilizan esta configuración, observamos que estos efectos pro-osteogénica persisten mucho después de que se suspendió el tratamiento de EStim.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí describimos la construcción de una cámara y un método para el tratamiento de células madre mesenquimales con EStim que se traduce en mayor diferenciación osteogénica.
La configuración de EStim presentada no requiere equipo especial/conocimientos y se puede realizar en un laboratorio de Biología/Bioquímica de la célula de vástago estándar por jóvenes investigadores. Sin embargo, al construir y utilizar la cámara EStim, especial debe tener cuidado en algunos pasos críticos. …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado en parte por una subvención de puesta en marcha de la Fundación AO (S-14-03 H) y la Fundación de Friedrichsheim (Stiftung Friedrichsheim) con sede en Fráncfort del Meno, Alemania.
Materials
| Estim fabrication | |||
| Banana connector/Jack adaptor | Poppstars | 1008554 | 2 pieces |
| Cutting pliers | Knipex | 78 03 125 | |
| DC power supply (0-30V/0-3A) | B&K Precision | Model 9130B | Any simular model could be used |
| Insulated flexible wires (0.14 mm2) | Conrad Electronic International | 604794, 604093 | 2 pieces |
| Non-corrosive silicone rubber | Dow Corning | 3140 RTV | *could be purchased by many stores |
| Platinum Wire (999,5/1000; 1mm ø) | Junker Edelmetalle | 00D-3010 | 0.6 m needed for 1 Estim chamber |
| 70% Ethanol solution | any | Sterilisation of Estim chamber | |
| Silver coated copper wire (0.6 mm ø) | Conrad Electronic International | 409334 – 62 | ≈70 cm needed for 1 Estim device |
| Soldering iron Set | Conrad Electronic International | 1611410 – 62 | Any simular model could be used |
| TPP 6-well plate lid | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | 2 lids for Estim chamber |
| 2.2V wired circular LEDs | Conrad Electronic International | 599525 – 62 | 6 pieces |
| UHU Super glue | UHU GmbH & Co. KG | n/a | *could be purchased by many stores |
| MSC culture | |||
| β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | osteogenic cell culture |
| DMEM, low glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo-Fischer Scientific | 21885025 | cell culture |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo-Fischer Scientific | 14190144 | cell culture |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | osteogenic cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo-Fischer Scientific | 10500064 | cell culture |
| 50 ml Falcon tube | Sarstedt | 62,547,004 | cell culture |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | osteogenic cell culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer Scientific | 15140122 | cell culture |
| Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymal stem cells, bone marrow origin | Cyagen | RASMX-01001 | cell culture |
| Cell detachment solution | Thermo-Fischer Scientific | A1110501 | cell culture, cell detachment |
| TC Flask, T75 | Sarstedt | 833911302 | cell culture |
| TPP 6-well plates | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | cell culture |
| Trypan Blue Dye, 0.4% solution | Bio-Rad | 1450021 | cell count |
Referencias
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