Überexprimierenden lange forensisches RNAs mit Gen-Aktivierung CRISPR
Summary
Traditionelle cDNA-basierte Überexpression Techniken haben eine begrenzte Anwendbarkeit für die Überexpression von lange forensisches RNAs aufgrund ihrer mehrere Spleiß-Formulare mit potenziellen Funktionalität. Dieser Beitrag berichtet ein Protokoll mit CRISPR-Technologie mehrere Splice-Varianten eine lange nichtcodierender RNA overexpress.
Abstract
Lange nichtcodierender RNA (LncRNA) Biologie ist ein neues und spannendes Forschungsfeld, mit der Anzahl der Publikationen aus diesem Bereich exponentiell seit 2007. Diese Studien haben bestätigt, dass LncRNAs in fast allen Krankheiten verändert sind. Studieren die funktionalen Rollen für LncRNAs im Zusammenhang mit der Krankheit bleibt jedoch schwierig, da der Mangel an Protein-Produkte, Gewebe-spezifischen Ausdruck, geringe Expression Ebenen Komplexität im Spleiß Formen und mangelnde Konservierung zwischen den Arten. Die artspezifischen Ausdruck gegeben, sind LncRNA Studien oft auf Humanforschung Kontexte beschränkt wenn Krankheitsprozesse zu studieren. Da LncRNAs auf molekularer Ebene funktionieren, ist Einweg, LncRNA Biologie zu sezieren, entfernen die LncRNA oder overexpress LncRNA und Maßnahme zelluläre Effekte. In diesem Artikel wird eine schriftliche und visualisierte Protokoll zum LncRNAs in-vitro-overexpress vorgestellt. Als repräsentatives Experiment zeigt ein LncRNA Zusammenhang mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen, Interferon-Gamma-Antisense-1 (IFNG-AS1), in einem Jurkat T-Zell-Modell überexprimiert werden. Um dies zu erreichen, wird die aktivierende gruppierten regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) Technik zur Überexpression an der endogenen genomic Loci zu ermöglichen. Die aktivierende CRISPR-Technik zielt auf eine Reihe von Transkriptionsfaktoren, die transkriptionelle Startseite eines Gens, eine robuste Überexpression von mehreren LncRNA Spleiß Formen ermöglichen. Dieses Verfahren wird in drei Schritten, nämlich (i) Guide RNA (gRNA) Design und Vektor Bau, (Ii) Virus-Generation und Transduktion und (Iii) Kolonie Screening für die Überexpression unterteilt werden. Für diese repräsentative Experiment größer als 20-fold Verbesserung der IFNG-AS1 in Jurkat T-Zellen beobachtet wurde.
Introduction
Während die biomedizinischer Forschung auf Protein-kodierenden Transkripte konzentriert hat, besteht die Mehrheit der transkribierten Gene eigentlich forensisches RNAs (Ensembl Release 93). Aktueller Forschung fängt an, dieses Feld mit der Zahl der Publikationen über LncRNAs in Krankheitsprozesse steigt exponentiell zwischen 2007 und 20171zu erkunden. Diese Publikationen zeigen, dass viele LncRNAs mit Krankheit verbunden sind. Allerdings sind die molekularen Mechanismen der diese LncRNAs schwer, aufgrund ihrer vielfältigen Funktionen im Vergleich zu mRNAs zu studieren. Erschwerend für das Verständnis der Rolle der LncRNAs bei Krankheit, werden LncRNAs oft auf einem niedrigeren Niveau als Kodierung RNAs2ausgedrückt. Darüber hinaus sind LncRNAs schlecht konserviert, die Grenzen der funktionellen Studies in Human-Zell-Linie-basierte Techniken3. Eine Methode, um den Mechanismus dieser neuartigen Gene studieren soll sie endogen in kultivierten Zellen overexpress. Überexpression Studien bieten wichtige Informationen über die Funktion bestimmter Gene und erlauben es, wichtige molekulare Signalwege zu sezieren.
Eine neue Methode zur Aktivierung der Transkription von Genen LncRNA basiert auf CRISPR-Technologien, die zunächst von Gersbach Labor4entwickelt. Dieses Protokoll wurde für den Einsatz in LncRNA Biologie und für den Ausdruck dieser Gene in andere Modellsystemen angepasst. In der CRISPR überexprimierenden Technik kann ein Protein namens CRISPR-assoziierten Protein 9 (Cas9) auf eine DNA-Sequenz über eine antisense gRNA gerichtet werden, die vom Cas9 erkannt wird. Normalerweise wird Cas9 DNA Spaltung induzieren; Mutationen im Cas9, die zuvor für die Überexpression Technik entwickelt deaktivieren jedoch diesen Schritt5. Wenn eine transcriptional Aktivator ist verschmolzen zu einem “Toten” Cas9 (dCas9) und ausgestrahlt in Zelllinien, die endogene Überexpression des LncRNAs kann erreicht4,6. Die Zugabe von zusätzlichen Änderungen an gRNA, ermöglichen zusätzliche transcriptional Faktoren binden an die gRNA erhöht die Wirksamkeit der dCas9-gen-Aktivierungs-System 10-divisibel7. Wichtiger ist, es konnte gezeigt werden, dass transkriptionelle Aktivierung Nähe erfordert (< 200 bp) auf die transkriptionelle Website Gene, ermöglichen eine spezifische Hochregulation in gen-reiche Gebiete7beginnen. Im Gegensatz zu CRISPR Ko-Technologien dCas9 und gRNA Kassetten in das Genom, um Zellen weiterhin eine Überexpression über mehrere Generationen hinweg ermöglichen integriert werden müssen. Eine Methode, um dies zu erreichen ist Lentiviren verwenden, um die dCas9 – und gRNA-haltigen Kassetten zu integrieren. Nach der Integration kann die LncRNA Genexpression ermittelt werden.
In diesem Artikel wird ein Protokoll für LncRNA Überexpression in einem Jurkat T-Zell-Modell demonstriert. Eine Schrittanleitung wird angezeigt und kann auch auf adhärente Zellen angepasst werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Manuskript stellt ein Protokoll für die Verwendung aktivieren CRISPR zur in-vitro-LncRNAs overexpress. Dies ist eine besonders wichtige Technik, wenn lange forensisches RNAs zu studieren, da das transkriptomischen Produkt der Funktionseinheit. Nach Überexpression können der Forscher dann diese Zellen das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen, wenn Bindungspartner studieren und sogar die zellulären Folgen der erhöhte Spiegel von LncRNAs zu messen. Darüber hinaus als LncRNAs häufig auf GUS-Gene wirken, ermög…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C.P stützt sich auf RO1 DK60729 und P30 DK 41301-26. D.P. stützt sich auf einen Morbus Crohn & Colitis Foundation (EKFF) Karriere Entwicklungspreis, Heilung: verdauungsfördernde Krankheiten Research Center (DDRC) DK41301 und UCLA klinischen und translationalen Science Institute (CTSI) UL1TR0001881. Die UCLA-Virologie-Kern wurde finanziert durch Center AIDS Forschung (CFAR) 5P 30 AI028697 zu gewähren. Die UCLA integrierten molekularen Technologien, den Kern von Heilung/P30 unterstützt wurde gewähren DK041301. Diese Arbeit wurde auch von der UCLA AIDS-Institut unterstützt.
Materials
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | |
| cDNA synthesis kit (iScript) | BioRad | 1708891 | |
| dCas9 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA |
| dCas9 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT |
| dCas9 vector | Addgene | 50918 | |
| DMEM | Corning | 10013CM | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-0010 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| gRNA plasmid | VectorBuilder | VB180119-1195qxv | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| HPRT1 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GACCAGTCAACAGGGGACAT |
| HPRT1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GCTTGCGACCTTGACCATCT |
| Hygromycin B | Corning | MT3024CR | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-500 | |
| Jurkat cells | ATCC | TIB-152 | clone E6-1 |
| L-glutamine | Corning | 25005Cl | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-2 | |
| Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit) | Qiagen | 12362 | |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | NIST2186II | |
| Optimem I reduced serum media | Gibco | 31985070 | |
| p24 elisa | Perkin Elmer | NEK050B | |
| PBS | Corning | 21-040-CMR | |
| Penicillin and Streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| pMDG2.G | Addgene | #12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | #60488 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Aldrich | P-4832 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003 | |
| pRSV-REV | Addgene | #12253 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNA purification kit (Aurum RNA mini) | BioRad | 7326820 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| SYBR green (iTaq universal) | BioRad | 1725122 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
Referencias
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