Overexpressing larga Noncoding RNAs mediante activación de gen CRISPR
Summary
Las técnicas tradicionales basados en cDNA sobreexpresión tienen una aplicabilidad limitada para la sobreexpresión de larga noncoding RNAs debido a sus múltiples formas de empalme con la funcionalidad potencial. Esta revisión informa un protocolo usando tecnología de CRISPR para sobreexpresar múltiples variantes de empalme de un ARN largo cubierta.
Abstract
Durante mucho tiempo los RNA (lncRNA) biología es un campo nuevo y emocionante de la investigación, con el número de publicaciones de este campo crece de manera exponencial desde el año 2007. Estos estudios han confirmado que lncRNAs se alteran en casi todas las enfermedades. Sin embargo, estudiando los roles funcionales de lncRNAs en el contexto de la enfermedad sigue siendo difícil debido a la falta de expresión tejido específica, niveles de expresión baja, productos proteicos, complejidades en formas de empalme y la falta de conservación entre las especies. Dada la expresión propios de cada especie, lncRNA estudios son a menudo restringidos a contextos de investigación al estudio de procesos de la enfermedad. Ya que lncRNAs la función a nivel molecular, una forma de diseccionar lncRNA biología es quitar el lncRNA o sobreexpresan los efectos celulares lncRNA y medida. En este artículo, se presenta un protocolo escrito y visualizar que sobreexpresan la lncRNAs in vitro. Como un experimento representativo, un lncRNA asociada a enfermedad inflamatoria intestinal, 1 de antisentido interferón Gamma (IFNG-AS1), muestra que es overexpressed en un modelo de Jurkat T-cell. Para lograr esto, la técnica activa de regularmente otro corto repite palindrómico (CRISPR) agrupado se utiliza para permitir que la sobreexpresión en los lugares geométricos genomic endógenas. La técnica CRISPR activa apunta a un conjunto de factores de transcripción a la página de inicio transcripcional de un gen, lo que permite una fuerte sobreexpresión de múltiples formas de empalme lncRNA. Este procedimiento se divide en tres pasos, a saber (i) guía RNA (gRNA) diseño y vector construcción, generación (ii) virus y transducción de señales y proyección (iii) Colonia de sobreexpresión. Para este experimento representativo, un mayor de 20-fold mejora en AS1 de IFNG en células Jurkat T se observó.
Introduction
Mientras que la investigación biomédica más se ha centrado en la codificación de proteínas transcripción, la mayoría de los genes transcritos consiste en realmente de noncoding RNAs (comunicado 93 de Ensembl). La investigación actual está empezando a explorar este campo, con el número de publicaciones en lncRNAs en procesos de la enfermedad aumentando exponencialmente entre 2007 y 20171. Estas publicaciones muestran que muchos lncRNAs se asocian con la enfermedad. Sin embargo, los mecanismos moleculares de estas lncRNAs son difíciles de estudiar debido a sus diversas funciones en comparación con los mRNAs. Agrava el problema de entender el papel de lncRNAs en la enfermedad, lncRNAs a menudo se expresan a niveles inferiores a codificación RNAs2. Además, lncRNAs se conservan mal, que limita los estudios funcionales en humanos célula-línea-técnicas basadas en3. Un método para estudiar el mecanismo de estos nuevos genes es endógeno los sobreexpresan en células cultivadas. Estudios de sobreexpresión pueden proporcionar información clave sobre la función de genes específicos y permiten a los investigadores a diseccionar las vías moleculares claves.
Un nuevo método para activar la transcripción de genes lncRNA se basa en tecnologías CRISPR desarrolladas inicialmente por el laboratorio de Gersbach4. Este protocolo ha sido adaptado para el uso en biología lncRNA y para la expresión de estos genes en otros sistemas del modelo. En el CRISPR overexpressing técnica, una proteína llamada proteína CRISPR 9 (Cas9) puede estar dirigida hacia una secuencia de ADN a través de un gRNA antisentido que es reconocido por Cas9. Normalmente, Cas9 inducirá la hendidura de la DNA; sin embargo, las mutaciones en el Cas9, desarrollada previamente en la técnica de sobreexpresión, desactivarán este paso5. Cuando un activador transcripcional está fusionado a un Cas9 «muertos» (dCas9) y transduced en líneas celulares, la sobreexpresión endógena de lncRNAs puede ser alcanzado4,6. La adición de modificaciones adicionales a la gRNA, permitiendo otros factores transcripcionales enlazar a la gRNA, aumentó la eficacia del sistema de activación de gen dCas9 10 veces7. Lo importante, se demostró que la activación transcripcional requiere proximidad (< 200 bp) empezar el transcripcional genes de sitio, lo que permite un upregulation específico en zonas ricas en genes7. A diferencia de tecnologías de nocaut CRISPR, cintas dCas9 y gRNA necesitan integrarse en el genoma para permitir para que las células conservan un énfasis excesivo sobre varias generaciones. Un método para lograrlo es utilizar lentiviruses para integrar los casetes que contienen la dCas9 y la gRNA. Tras la integración, la expresión del gen lncRNA puede ser determinada.
En este artículo, se demostrará un protocolo para lncRNA sobreexpresión en un modelo de Jurkat T-cell. Un procedimiento paso a paso se muestra y puede ser adaptado también a células adherentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este manuscrito presenta un protocolo para utilizar activar CRISPR para sobreexpresar lncRNAs in vitro. Se trata de una técnica especialmente importante al estudiar la larga noncoding RNAs como producto transcriptómicos es la unidad funcional. Después de sobreexpresión, el investigador puede, entonces, utilizar estas células para aumentar la relación señal a ruido al estudiar a socios de enlace y medir incluso las consecuencias celulares de aumento de los niveles de lncRNAs. Además, como lncRNAs con frecuencia ac…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C.P. es apoyado por DK60729 to1 y P30 DK 41301-26. D.P. es apoyado por un Crohn & Colitis Foundation (CCFA) de carrera Premio desarrollo, curación: DK41301 centro de investigación de enfermedades digestivas (DDRC) y clínica de UCLA y UL1TR0001881 Instituto de ciencia traslacional (CTSI). El centro de virología de la UCLA fue financiado por el centro de investigación del SIDA (CFAR) concede 30 P 5 AI028697. Las tecnologías moleculares integradas de UCLA núcleo fue apoyado por curación/P30 conceder DK041301. Este trabajo fue apoyado también por el Instituto de SIDA de UCLA.
Materials
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | |
| cDNA synthesis kit (iScript) | BioRad | 1708891 | |
| dCas9 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA |
| dCas9 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT |
| dCas9 vector | Addgene | 50918 | |
| DMEM | Corning | 10013CM | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-0010 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| gRNA plasmid | VectorBuilder | VB180119-1195qxv | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| HPRT1 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GACCAGTCAACAGGGGACAT |
| HPRT1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GCTTGCGACCTTGACCATCT |
| Hygromycin B | Corning | MT3024CR | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-500 | |
| Jurkat cells | ATCC | TIB-152 | clone E6-1 |
| L-glutamine | Corning | 25005Cl | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-2 | |
| Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit) | Qiagen | 12362 | |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | NIST2186II | |
| Optimem I reduced serum media | Gibco | 31985070 | |
| p24 elisa | Perkin Elmer | NEK050B | |
| PBS | Corning | 21-040-CMR | |
| Penicillin and Streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| pMDG2.G | Addgene | #12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | #60488 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Aldrich | P-4832 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003 | |
| pRSV-REV | Addgene | #12253 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNA purification kit (Aurum RNA mini) | BioRad | 7326820 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| SYBR green (iTaq universal) | BioRad | 1725122 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
Referencias
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