Superexpressão de tempo não-codificante RNAs usando CRISPR ativando o Gene
Summary
Técnicas tradicionais baseados em cDNA superexpressão têm uma aplicabilidade limitada para a superexpressão de tempo não-codificante RNAs devido às suas múltiplas formas de tala com funcionalidade potencial. Esta revisão relata um protocolo utilizando tecnologia CRISPR para overexpress múltiplas variantes da tala de um RNA não-codificante longo.
Abstract
Há muito tempo não codificante biologia do RNA (lncRNA) é um novo e excitante campo de pesquisa, com o número de publicações deste campo crescendo exponencialmente desde 2007. Estes estudos têm confirmado que os lncRNAs sejam alteradas em quase todas as doenças. No entanto, estudar as funções funcionais para lncRNAs no contexto da doença continua a ser difícil devido à falta de produtos proteicos, expressão tecido-específica, níveis baixos de expressão, complexidades em formulários da tala e falta de conservação entre espécies. Dada a expressão espécie-específicas, estudos lncRNA são restritos aos contextos de investigação humana quando estudando processos de doença. Desde que lncRNAs funcionar a nível molecular, uma maneira de dissecar lncRNA biologia é para remover o lncRNA ou overexpress os efeitos celulares lncRNA e medida. Neste artigo, é apresentado um protocolo escrito e visualizado a overexpress lncRNAs in vitro. Como um experimento de representante, um lncRNA associado com doença inflamatória intestinal, Interferon gama antisentido 1 (IFNG-AS1), é mostrado para ser overexpressed em um modelo de células Jurkat T. Para fazer isso, a técnica de regularmente intercaladas curta palíndromo repetições (CRISPR) em cluster de activação é usada para habilitar a superexpressão no locus genômicos endógenas. A técnica CRISPR activação destina-se um conjunto de factores de transcrição para o site iniciar transcricional de um gene, permitindo um robusto superexpressão de múltiplas formas de tala de lncRNA. Este procedimento irá ser dividido em três etapas, ou seja (i) guia construção design e vetor de RNA (gRNA), (ii) o vírus a geração e transdução e triagem (iii) a colônia para superexpressão. Para esta experiência representativa, um maior do que 20-fold realce em IFNG-AS1 em células Jurkat T foi observada.
Introduction
Enquanto investigação biomédica mais concentrou-se transcritos codificantes de proteínas, a maioria dos genes transcritos na verdade consiste de RNA não-codificante (liberação de Ensembl 93). A pesquisa atual está começando a explorar este campo, com o número de publicações sobre lncRNAs em processos de doença crescente exponencialmente entre 2007 e 20171. Estas publicações demonstram que muitos lncRNAs estão associados com doença. No entanto, os mecanismos moleculares de lncRNAs estes são difíceis de estudar devido a suas diversas funções em comparação com os mRNAs. Compondo o problema de compreender o papel da lncRNAs na doença, lncRNAs exprimem-se frequentemente a codificação RNAs2níveis inferiores. Além disso, lncRNAs são mal conservadas, que limita os estudos funcionais na célula linha-humanas técnicas3. Um método para estudar o mecanismo destes genes romance é endogenamente overexpress-los em pilhas cultivadas. Estudos de superexpressão podem fornecer informações chaves sobre a função dos genes específicos e permitir aos investigadores principais vias moleculares de dissecar.
Um novo método para ativar a transcrição de genes lncRNA é baseado em tecnologias CRISPR desenvolvidas inicialmente pela Gersbach laboratório4. Este protocolo foi adaptado para uso em lncRNA biologia e para a expressão destes genes em outros sistemas de modelo. No CRISPR superexpressão técnica, uma proteína chamada proteína associada CRISPR 9 (Cas9) pode ser direcionada para uma sequência de DNA através de uma gRNA antisentido é reconhecido por Cas9. Normalmente, Cas9 induzirá a clivagem de DNA; no entanto, mutações em Cas9, anteriormente desenvolvido para a técnica de superexpressão, desativar esta etapa5. Quando um ativador transcricional é fundido a uma Cas9 “morto” (dCas9) e transformados em linhas de células, a superexpressão endógena de lncRNAs pode ser alcançado4,6. A adição de modificações adicionais para a gRNA, permitindo que fatores transcricionais adicionais ligar a gRNA, aumentou a eficácia do sistema de ativação do gene dCas9 10 vezes7. Importante, foi demonstrado que a ativação transcricional requer proximidade (< 200 bp) para o transcriptional começar genes local, permitindo uma upregulation específica em áreas ricas gene7. Ao contrário de tecnologias de nocaute CRISPR, dCas9 e gRNA cassettes precisam ser integrado no genoma para permitir células reter uma superexpressão ao longo de várias gerações. Um método para alcançar este objectivo é usar lentivírus para integrar as fitas dCas9 e gRNA-contendo. Após a integração, a expressão do gene de lncRNA pode ser determinada.
Neste artigo, será demonstrado um protocolo para superexpressão de lncRNA em um modelo de células Jurkat T. Um procedimento passo a passo é mostrado e também pode ser adaptado para células aderentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este manuscrito apresenta um protocolo para usar ativação CRISPR para overexpress lncRNAs in vitro. Esta é uma técnica especialmente importante quando estudar há muito tempo não codificante RNAs como o produto do transcriptomic é a unidade funcional. Depois superexpressão, o pesquisador pode, então, usar essas células para aumentar a relação sinal-ruído quando estudar parceiros de ligação e nem medir as consequências celulares de aumento dos níveis de lncRNAs. Além disso, como lncRNAs frequentemente age…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C.P. é apoiado por RO1 DK60729 e P30 DK 41301-26. D.P. é suportado por um de Crohn e colite Foundation (CCFA) carreira desenvolvimento award, cura: centro de investigação de doenças digestivas (DDRC) DK41301 e UCLA clínica e Instituto de ciência translacional (CTSI) UL1TR0001881. O núcleo de virologia da UCLA foi financiado pelo centro de pesquisa AIDS (CFAR) conceder 5P 30 AI028697. As tecnologias de Molecular integrada da UCLA núcleo foi apoiado pela cura/P30 conceder DK041301. Este trabalho também foi apoiado pelo Instituto de AIDS da UCLA.
Materials
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | |
| cDNA synthesis kit (iScript) | BioRad | 1708891 | |
| dCas9 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA |
| dCas9 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT |
| dCas9 vector | Addgene | 50918 | |
| DMEM | Corning | 10013CM | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-0010 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| gRNA plasmid | VectorBuilder | VB180119-1195qxv | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| HPRT1 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GACCAGTCAACAGGGGACAT |
| HPRT1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GCTTGCGACCTTGACCATCT |
| Hygromycin B | Corning | MT3024CR | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-500 | |
| Jurkat cells | ATCC | TIB-152 | clone E6-1 |
| L-glutamine | Corning | 25005Cl | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-2 | |
| Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit) | Qiagen | 12362 | |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | NIST2186II | |
| Optimem I reduced serum media | Gibco | 31985070 | |
| p24 elisa | Perkin Elmer | NEK050B | |
| PBS | Corning | 21-040-CMR | |
| Penicillin and Streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| pMDG2.G | Addgene | #12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | #60488 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Aldrich | P-4832 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003 | |
| pRSV-REV | Addgene | #12253 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNA purification kit (Aurum RNA mini) | BioRad | 7326820 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| SYBR green (iTaq universal) | BioRad | 1725122 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
Referencias
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