Aquí, se describen los protocolos para el aislamiento de polímeros de carbohidratos liberados por cianobacterias y el aislamiento de sus exoproteomes. Ambos procedimientos incorporan pasos clave para obtener polímeros o proteínas con grados de alta pureza que se pueden utilizar para análisis o aplicaciones adicionales. También se pueden adaptar fácilmente según las necesidades específicas del usuario.
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Artículo de método
Mirando hacia afuera: Aislamiento de polímeros y proteínas de carbohidratos liberados de cianobacteria
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Resumen
Resumen
Las cianobacterias pueden secretar activamente una amplia gama de biomoléculas en el entorno extracelular, como los heteropolisacáridos y las proteínas. La identificación y caracterización de estas biomoléculas puede mejorar el conocimiento sobre sus vías de secreción y ayudar a manipularlas. Además, algunas de estas biomoléculas también son interesantes en términos de aplicaciones biotecnológicas. Aquí se describen dos protocolos para el aislamiento fácil y rápido de polímeros y proteínas de carbohidratos liberados por cianobacterias. El método de aislamiento de polímeros de carbohidratos liberados se basa en técnicas convencionales de precipitación de polisacáridos en soluciones acuosas utilizando disolventes orgánicos. Este método preserva las características del polímero y al mismo tiempo evita la presencia de contaminantes de los desechos celulares y el medio de cultivo. Al final del proceso, el polímero liofilizado está listo para ser utilizado o caracterizado o puede ser sometido a más rondas de purificación, dependiendo del uso final previsto. En cuanto al aislamiento del exoproteoma cianobacteriano, la técnica se basa en la concentración del medio libre de células después de la eliminación de los principales contaminantes por centrifugación y filtración. Esta estrategia permite un aislamiento fiable de las proteínas que alcanzan el medio extracelular a través de transportadores de membrana o vesículas de membrana externa. Estas proteínas se pueden identificar posteriormente utilizando técnicas estándar de espectrometría de masas. Los protocolos presentados aquí se pueden aplicar no sólo a una amplia gama de cianobacterias, sino también a otras cepas bacterianas. Además, estos procedimientos se pueden adaptar fácilmente según el uso final de los productos, el grado de pureza requerido y la cepa bacteriana.
Introducción
Las cianobacterias son ampliamente reconocidas como fuentes prolíficas de productos naturales con aplicaciones biotecnológicas/biomédicas prometedoras. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos de secreción cianobacteriana y la optimización de los métodos de extracción/recuperación son esenciales para implementar cianobacterias como fábricas de células microbianas eficientes.
Muchas cepas cianobacterianas son capaces de producir sustancias poliméricas extracelulares (EPS), formadas principalmente porheteropolisacáridos, que permanecen asociadas a la superficie celular o se liberan en el medio 1. Estos polímeros ....
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Protocolo
1. Aislamiento de polímero de carbohidratos liberado por cianobacteria
-
Aislamiento de polímeros y eliminación de contaminantes
- Cultivar la cepa cianobacteriana en condiciones estándar [p. ej., 30 oC bajo una luz de 12 h (50 oEm s 2s x1) /12 h de régimen oscuro, con temblor orbital a 150 rpm]. Mida el crecimiento utilizando protocolos estándar [por ejemplo, densidad óptica a 730 nm (OD730nm),clorofila a, peso seco, etc.], luego mida la producción de polisacáridos liberados según el método de ácido fenol-sulfúrico16.
- Transfiera el cultivo a membranas de diálisis (12-14 ....
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Resultados
En la Figura 1se muestra una representación esquemática del método descrito para extraer polímeros de carbohidratos liberados de cultivos cianobacterianos. Los polímeros precipitados del productor moderado de EPS cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 y el eficiente productor de EPS Cyanothece sp. En la Figura3, se muestran polímeros liofilizados con diferentes grados de contaminación, destacando la importancia .......
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Discusión
Para comprender mejor los mecanismos de secreción bacteriana y estudiar los productos liberados, es de extrema importancia demostrar el aislamiento y análisis eficientes de las biomoléculas presentes en el entorno bacteriano extracelular (como polímeros de carbohidratos y proteínas).
Los polímeros de carbohidratos extracelulares cianobacterianos son extremadamente complejos, principalmente debido al número y proporción de diferentes monosacáridos que constituyen su composición
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por los fondos de la Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) a través del Programa DE Competitividad e Internacionalización (POCI) COMPETE 2020, Portugal 2020, y por fondos portugueses a través del FCT - Fundación para la Ciencia y el Programa De Lancia e A Tecnologia/Ministério da Ciéncia, Tecnologia e Ensino Superior en el marco del proyecto POCI-01-0145-FEDER-028779 y la subvención SFRH/BD/99715/2014 (CF).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Membranas de diálisis | Medicell Membranes Ltd | DTV.12000.07 | Tubo Visking Tamaño 7, Diámetro 23,8 mm, Ancho 39-41 mm 30m Rollo |
| Etanol 96% | AGA - Á lcool e Gé neros Alimentares, S.A. | 4.000.02.02.00 | Fermentación alcohol etílico 96% AGA |
| PES Filtro 0,2 μ m | Fisher Scientific, Lda | 15206869 | Jeringa filtro poliestireno 33MM 0.2µ M STR |
| Amicon Ultra-15, Ultracel-3K | Merck Millipore Ltd. | UFC900324 | Filtros centrífugos con un límite de peso molecular nominal de 3 kDa |
| Thermo Scientific Ensayo de proteínas Pierce BCA | Fisher Scientific, Lda | 10741395 | Reactivo de ensayo de verde a azul, preciso y compatible con detergentes para medir la concentración total de proteínas |
| Concentrado coloidal de Brillant Blue G | Sigma Aldrich Quí mica SL | B2025-1EA | Coomassie azul |
Referencias
- Pereira, S., et al. Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly. FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).
- Kanekiyo, K., et al.
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