Взгляд наружу: Изоляция цианобактериальных высвобождаемых углеводных полимеров и белков
Summary
Здесь описаны протоколы изоляции цианобактериальных высвобождаемых углеводных полимеров и изоляции их экзопротеомов. Обе процедуры воплощают ключевые шаги для получения полимеров или белков с высокой степенью чистоты, которые могут быть использованы для дальнейшего анализа или применения. Они также могут быть легко адаптированы в соответствии с конкретными потребностями пользователей.
Abstract
Цианобактерии могут активно выделять широкий спектр биомолекул во внеклеточной среде, таких как гетерополисачхариды и белки. Идентификация и характеристика этих биомолекул может улучшить знания об их путях секреции и помочь манипулировать ими. Кроме того, некоторые из этих биомолекул также интересны с точки зрения биотехнологических применений. Описаны два протокола для легкой и быстрой изоляции цианобактериальных высвобождаемых углеводных полимеров и белков. Метод изоляции высвобожденных углеводных полимеров основан на обычных методах осадков полисахаридов в вацвовых растворах с использованием органических растворителей. Этот метод сохраняет характеристики полимера и одновременно позволяет избежать присутствия загрязняющих веществ из клеточного мусора и культуры среды. В конце процесса лиофилизированный полимер готов к использованию или характеристике или может быть подвергнут дальнейшим раундам очистки, в зависимости от конечного предназначенного использования. Что касается изоляции цианобактериального экзопротеома, метод основан на концентрации среды, свободной от клеток, после удаления основных загрязнителей путем центрифугации и фильтрации. Эта стратегия позволяет обеспечить надежную изоляцию белков, которые достигают внеклеточной среды через мембранные транспортеры или внешние мембранные пузырьки. Эти белки могут быть впоследствии идентифицированы с помощью стандартных методов масс-спектрометрии. Представленные здесь протоколы могут применяться не только к широкому спектру цианобактерий, но и к другим бактериальным штаммам. Кроме того, эти процедуры могут быть легко с учетом окончательного использования продуктов, степень чистоты требуется, и бактериальный штамм.
Introduction
Цианобактерии широко признаны в качестве плодовитых источников натуральных продуктов с перспективными биотехнологическими/биомедицинскими применениями. Поэтому понимание механизмов секреции цианобактерий и оптимизация методов извлечения/восстановления необходимы для внедрения цианобактерий как эффективных фабрик микробных клеток.
Многие цианобактериальные штаммы способны производить внеклеточные полимерные вещества (EPS), в основном образованные гетерополисахаридов, которые остаются связаны с поверхностью клетки или высвобождаются в среду1. Эти выпущенные углеводные полимеры имеют различные особенности по сравнению с другими бактериями, которые делают их пригодными для широкого спектра применений (например, противовирусные2, иммуностимулятор3, антиоксидант4, металл-хелатирование5, эмульгирующий6,и агенты доставки лекарств7,8). Методология изоляции этих полимеров во многом способствует не только повышению урожайности, но и повышению чистоты и специфических физических свойств полученного9полимера. Подавляющее большинство из этих методов для изоляции полимеров полагаться на осадки стратегии из культуры среды, которые легко достигается из-за сильной анионической природы полимера9,10. Кроме того, удаление растворителей, используемых в шаге осадков, может быть быстро достигнуто путем испарения и/или лиофилизации. В зависимости от предполагаемого применения, различные шаги могут быть соединены либо после или до выпадения полимера для того, чтобы адаптировать конечный продукт, который включает в себя трихлороацетической кислоты (TCA) лечение, фильтрация, или размер исключения хроматографии (SEC) очистка столбца10.
Цианобактерии также способны выделять широкий спектр белков через пути, зависящие от мембранных транспортеров (классические)11 или опосредованных пузырьками (неклассическими)12. Таким образом, анализ цианобактериального экзопротеома представляет собой важный инструмент, как понять / манипулировать механизмами секреции цианобактерий белка и понять специфическую внеклеточную функцию этих белков. Надежная изоляция и анализ экзопротеомов требуют концентрации внеклеточной среды, так как обилие выделяемых белков относительно низкое. Кроме того, другие физические или химические шаги (например, центрифугация, фильтрация или протеиновые осадки) могут оптимизировать качество полученного экзопротеома, обогащая содержание белка13и избегая присутствия загрязняющих веществ (например, пигменты, углеводы и т.д.. . 14 Год , 15 или преобладание внутриклеточных белков в образцах. Тем не менее, некоторые из этих шагов могут также ограничить набор белков, которые могут быть обнаружены, что приводит к предвзятому анализу.
Эта работа описывает эффективные протоколы для изоляции выпущенных углеводных полимеров и экзопротеомов от цианобактерий культуры средств массовой информации. Эти протоколы могут быть легко адаптированы к конкретным целям и потребностям пользователей исследования, сохраняя при этом основные шаги, представленные здесь.
Protocol
Representative Results
Discussion
Чтобы лучше понять механизмы бактериальной секреции и изучить высвобожденные продукты, крайне важно продемонстрировать эффективную изоляцию и анализ биомолекул, присутствующих в внеклеточной бактериальной среде (например, выпущенных углеводных полимеров и белков).
Ц?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была профинансирована Фондом Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) в рамках программы COMPETE 2020 – Operacional Program for Competitiveness and Internationalisation (POCI), Португалия 2020, а также португальскими фондами через FCT – Funda’o para a Ci’ncia e Текнология/Минстерио да Сьенсия, Tecnologia e Ensino Superior в рамках проекта POCI-01-0145-FEDER-028779 и грант SFRH/BD/99715/2014 (CF).
Materials
| Dialysis membranes | Medicell Membranes Ltd | DTV.12000.07 | Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll |
| Ethanol 96% | AGA – Álcool e Géneros Alimentares, S.A. | 4.000.02.02.00 | Fermentation ethyl alcohol 96% AGA |
| PES Filter 0.2 μm | Fisher Scientific, Lda | 15206869 | Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR |
| Amicon Ultra-15, Ultracel-3K | Merck Millipore Ltd. | UFC900324 | Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Fisher Scientific, Lda | 10741395 | Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration |
| Brillant Blue G Colloidal Concentrate | Sigma Aldrich Química SL | B2025-1EA | Coomassie blue |
Referencias
- Pereira, S., et al. Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly. FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).
- Kanekiyo, K., et al. Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme. Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).
- Løbner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis. Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).
- Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities. Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).
- Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition. Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).
- Han, P. P., et al. Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme. Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).
- Leite, J. P., et al. Cyanobacterium‐Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins. Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206 (2017).
- Estevinho, B. N., et al. Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12. Powder Technology. 343, 644-651 (2019).
- Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation. Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).
- Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides. Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).
- Costa, T. R., et al. Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).
- Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications. Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).
- Sergeyenko, T. V., Los, D. A. Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).
- Oliveira, P., et al. The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).
- Flores, C., et al. The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).
- Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).
- Parikh, A., Madamwar, D. Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria. Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).
- Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides. Frontiers in Microbiology. 6, 565 (2015).
- Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore. Marine Glycobiology. , 343-358 (2016).
- Nguyen, A. T. B., et al. Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt. Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).
- Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup. International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).
- Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).
