Olhando para fora: isolamento de cianobactérias liberado polímeros de carboidratos e proteínas
Summary
Aqui, os protocolos para o isolamento de cianobactérias liberado polímeros de carboidratos e isolamento de seus exoproteomes são descritos. Ambos os procedimentos incorporam etapas-chave para obter polímeros ou proteínas com graus de alta pureza que podem ser usados para posterior análise ou aplicações. Eles também podem ser facilmente adaptados de acordo com as necessidades específicas do usuário.
Abstract
A cianobactéria pode secretar ativamente uma ampla gama de biomoléculas para o ambiente extracelular, como heteropolissacarídeos e proteínas. A identificação e caracterização dessas biomoléculas podem melhorar o conhecimento sobre suas vias de secreção e ajudar a manipulá-las. Além disso, algumas dessas biomoléculas também são interessantes em termos de aplicações biotecnológicas. Descritos aqui estão dois protocolos para o isolamento fácil e rápido de cianobactérias liberado polímeros de carboidratos e proteínas. O método de isolamento de polímeros de carboidratos liberados é baseado em técnicas convencionais de precipitação de polissacarídeos em soluções aquosas utilizando solventes orgânicos. Este método preserva as características do polímero e, simultaneamente, evita a presença de contaminantes de detritos celulares e meio de cultura. No final do processo, o polímero liofilizado está pronto para ser usado ou caracterizado ou pode ser submetido a novas rodadas de purificação, dependendo do uso final pretendido. Em relação ao isolamento do exoproteoma cianobactérias, a técnica baseia-se na concentração do meio livre de células após a remoção dos principais contaminantes por centrifugação e filtração. Essa estratégia permite o isolamento confiável de proteínas que atingem o meio extracelular através de transportadores de membrana ou vesículas de membrana externa. Essas proteínas podem ser posteriormente identificadas usando técnicas de espectrometria de massas padrão. Os protocolos aqui apresentados podem ser aplicados não apenas a uma ampla gama de cianobactérias, mas também a outras cepas bacterianas. Além disso, estes procedimentos podem facilmente ser costurados de acordo com o uso final dos produtos, o grau da pureza exigido, e a tensão bacteriana.
Introduction
As cianobactérias são amplamente reconhecidas como fontes prolíficas de produtos naturais com promissoras aplicações biotecnológicas/biomédicas. Portanto, a compreensão dos mecanismos de secreção de cianobactérias e a otimização dos métodos de extração/recuperação são essenciais para implementar cianobactérias como eficientes fábricas de células microbianas.
Muitas cepas de cianobactérias são capazes de produzir substâncias poliméricos extracelulares (EPS), formadas principalmente por heteropolissacarídeos, que permanecem associadas à superfície celular ou são liberados para o meio1. Estes polímeros de carboidratos liberados têm características distintas em comparação com aqueles de outras bactérias, que os tornam adequados para uma ampla gama de aplicações (por exemplo, antivirais2, imunoterapia Imunoestimulador3, antioxidante4, metal-quelante5, emulsificante6, e agentes de entrega de fármacos7,8). A metodologia para o isolamento desses polímeros contribui, em grande parte, não só para a melhoria da produtividade, mas também para o aumento da pureza e as propriedades físicas específicas do polímero obtido9. A grande maioria destes métodos de isolamento dos polímeros dependem de estratégias de precipitação do meio de cultura que são facilmente realizadas devido à forte natureza aniônica do polímero9,10. Além disso, a remoção dos solventes utilizados na etapa de precipitação pode ser rapidamente alcançada por evaporação e/ou liofilização. Dependendo da aplicação prevista, podem ser acoplados diferentes passos, quer após ou antes da precipitação do polímero, a fim de adaptar o produto final, que incluem o tratamento com ácido tricloroacético (TCA), filtração ou cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) purificação de coluna10.
As cianobactérias também são capazes de secretar uma ampla gama de proteínas através de vias dependentes de transportadores de membrana (clássica)11 ou mediadas por vesículas (não-clássicas)12. Portanto, a análise do exoproteoma cianobactérias constitui uma ferramenta essencial, tanto para compreender/manipular os mecanismos de secreção de proteínas cianobactérias quanto para compreender a função extracelular específica dessas proteínas. A isolação e a análise confiáveis de exoproteomes exigem a concentração do Milieu extracelular, desde que a abundância de proteínas secretado é relativamente baixa. Além disso, outras etapas físicas ou químicas (por exemplo, centrifugação, filtração ou precipitação protéica) podem otimizar a qualidade do exoproteoma obtido, enriquecedora do conteúdo proteico13, e evitando a presença de contaminantes (por exemplo, pigmentos, hidratos de carbono, etc.) 14 anos de , 15 ou a predominância de proteínas intracelulares nas amostras. No entanto, algumas dessas etapas também podem restringir o conjunto de proteínas que podem ser detectadas, levando a uma análise tendenciosa.
Este trabalho descreve protocolos eficientes para o isolamento de polímeros de carboidratos liberados e exoproteomes de meios de cultura de cianobactérias. Esses protocolos podem ser facilmente adaptados aos objetivos específicos do estudo e às necessidades dos usuários, mantendo as etapas básicas aqui apresentadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para compreender melhor os mecanismos de secreção bacteriana e estudar os produtos liberados, é de extrema importância demonstrar o isolamento e a análise eficientes das biomoléculas presentes no ambiente bacteriano extracelular (como o liberado polímeros e proteínas de carboidratos).
Os polímeros de carboidratos extracelulares de cianobactérias são extremamente complexos, principalmente devido ao número e proporção de diferentes monossacarídeos que constituem sua composição<s…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelos fundos do Fundo Europeu de desenvolvimento regional (FEDER) através do programa de competitividade e internacionalização da 2020 concorrência (POCI), Portugal 2020 e dos fundos portugueses através da FCT-Fundação para a ciência e a tecnologia/Ministério da ciência, tecnologia e ensino superior no âmbito do projecto POCI-01-0145-FEDER-028779 e a subvenção SFRH/BD/99715/2014 (CF).
Materials
| Dialysis membranes | Medicell Membranes Ltd | DTV.12000.07 | Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll |
| Ethanol 96% | AGA – Álcool e Géneros Alimentares, S.A. | 4.000.02.02.00 | Fermentation ethyl alcohol 96% AGA |
| PES Filter 0.2 μm | Fisher Scientific, Lda | 15206869 | Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR |
| Amicon Ultra-15, Ultracel-3K | Merck Millipore Ltd. | UFC900324 | Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Fisher Scientific, Lda | 10741395 | Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration |
| Brillant Blue G Colloidal Concentrate | Sigma Aldrich Química SL | B2025-1EA | Coomassie blue |
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