Menschliche Blastozysten Biopsie und Vitrifikation
Summary
Blastozystenbiopsie und Vitrifikation sind erforderlich, um Präimplantations-Gentests effizient durchzuführen. Ein Ansatz, der die sequenzielle Öffnung der Zona pellucida und die Rückgewinnung von 7-8 Trophektodermzellen in Tag 5-7 nach der Besamung einschließt, begrenzt sowohl die Anzahl der erforderlichen Manipulationen als auch die Exposition des Embryos gegenüber suboptimalen Umweltbedingungen.
Abstract
Blastozysten-Biopsie wird durchgeführt, um eine zuverlässige genetische Diagnose während IVF-Zyklen mit Präimplantations-Gentests zu erhalten. Dann beinhaltet der ideale Arbeitsablauf ein sicheres und effizientes Verglasungsprotokoll, aufgrund der Durchlaufzeit der Diagnostischen Techniken und die Übertragung der ausgewählten Embryonen auf ein physiologisches Endometrium in einem folgenden natürlichen Zyklus. Ein Biopsieansatz, der die sequenzielle Öffnung der Zona pellucida und die Rückgewinnung von 5-10 Trophektodermzellen (idealerweise 7-8) umfasst, begrenzt sowohl die Anzahl der erforderlichen Manipulationen als auch die Exposition des Embryos gegenüber suboptimalen Umgebungsbedingungen. Nach der richtigen Schulung war die Technik bei verschiedenen Bedienern reproduzierbar in Bezug auf den Zeitpunkt der Biopsie (8 min, 3-22 min basierend auf der Anzahl der Embryonen bis zur Biopsie pro Schale), schlüssige Diagnosen erhalten (97,5%) und Lebendgeburten nach verglast-gewärmerwärmener euploiden Blastozystenübertragung (>40%). Die Überlebensrate nach Biopsie, Verglasung und Erwärmung lag bei 99,8%. Die Re-Expansionsrate bei 1,5 h aus der Erwärmung betrug bis zu 97%, weitgehend abhängig vom Zeitpunkt zwischen Biopsie und Vitrifikation (idealerweise 30 min), blastozystmorphologischeR Qualität und Tag der Biopsie. Im Allgemeinen ist es besser, eine zusammengebrochene Blastozyste zu vitrify; Daher kann in Nicht-PGT-Zyklen laserunterstützte künstliche Schrumpfung durchgeführt werden, um den Embryokollaps vor der Kryokonservierung zu induzieren. Die vielversprechendste Zukunftsperspektive ist die nicht-invasive Analyse der IVF-Kulturmedien nach Blastozystenkultur als vermeintliche Quelle embryonaler DNA. Diese potenzielle Avantgarde wird jedoch noch untersucht, und ein zuverlässiges Protokoll muss noch definiert und validiert werden.
Introduction
Das Hauptziel der modernen menschlichen Embryologie ist es, die Anzahl der Lebendgeburten pro stimulierten Zyklus zu maximieren und Kosten, Zeit und Anstrengungen zu reduzieren, um eine Schwangerschaft zu erreichen. Um dieses Ziel zu erreichen, sollten validierte Ansätze für die Embryonenauswahl verwendet werden, um reproduktiv kompetente Embryonen innerhalb einer Kohorte zu identifizieren, die während eines IVF-Zyklus erhalten wurde. Nach den neuesten Erkenntnissen ist Blastozystenkultur1 in Kombination mit umfassenden Chromosomentests und verglast-gewärmtem euploiden Embryotransfer (ET) der effizienteste Rahmen zur Steigerung der IVF-Effizienz2. Natürlich erfordert ein Aneuploidie-Test eine embryonale Probe, die derzeit meist aus wenigen Zellen aus dem Trophektoderm (TE) dargestellt wird, d. h. dem Abschnitt der Blastozyste, der während der Schwangerschaft den Ursprung von Embryoanhängen (z. B. der Plazenta) gibt. . Neben der Karyotyp-Analyse könnten auch einzelne Genmutationen aus einer TE-Biopsie als Teil einer klinischen Strategie bewertet werden, die als Präimplantationsgenztest bekannt ist (PGT; -A für Aneuploidies, -SR für strukturelle chromosomale Umlagerungen, -M für monogene Krankheiten). Andere Eizellen-/Embryo-Biopsiemethoden wurden in den letzten Jahrzehnten klinisch theoretisiert und übernommen, nämlich Polarkörperbiopsie und Blastomerbiopsie. Ihre Verwendung ist heutzutage jedoch geringer, da ihre verfahrenstechnischen Nachteile (z. B. höhere Arbeitsbelastung und Risiko für reproduktive Auswirkungen) und diagnostische Einschränkungen (z. B. Einzelzellanalyseprobleme) implizit ein ausreichendes Gleichgewicht zwischen Kosten, Risiken und Vorteile (für eine Überprüfung siehe3).
In diesem Beitrag wird eines der wichtigsten Protokolle für die TE-Biopsie zusammen mit den nachfolgenden Verglasungs-, Erwärmungs- und Transferverfahren ausführlich beschrieben. Der hier beschriebene Workflow ist ideal für eine ausgelastete PGT-Einheit.
Wie bereits von unserer Gruppe4,5beschrieben, beinhaltet das Verfahren die sequenzielle Öffnung der Zona pellucida von voll expandierten Blastozysten und die Entfernung von wenigen TE-Zellen (im Durchschnitt 7-8). Im Vergleich zum Tag 3 laserunterstützte Brut-basierte Blastozysten-Biopsie-Methode6, könnte dieses Verfahren den täglichen Zeitplan einer IVF-Einheit erleichtern, wo empfindliche Verfahren, wie Blastozystenbiopsie und Vitrifikation, rechtzeitig durchgeführt werden müssen. Sobald die Blastozyste ihre volle Ausdehnung erreicht, kann die Biopsie durchgeführt werden, indem die zu entfernenden TE-Zellen ausgewählt werden, wodurch das Risiko eines Abreihens der inneren Zellmasse (ICM) verhindert wird, was das Verfahren sonst schwierig machen würde. In der Literatur wurde auch ein drittes Protokoll der Blastozystenbiopsie beschrieben, das lasergestütztes Schlüpfen beinhaltet, sobald der Embryo das Blastozystenstadium bereits erreicht hat, wenige Stunden vor dem Eingriff5,7. Dieser Ansatz ist jedoch zeitaufwändiger und eignet sich vor allem für IVF-Einheiten, die die TE-Biopsie in den Händen von begrenzt erfahrenen Bedienern und angesichts einer mäßig niedrigen täglichen Arbeitsbelastung implementieren.
Die intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI)8 sollte eine konsolidierte Technik sein, wenn genetische Analysen in IVF durchgeführt werden sollen. Ebenso ist ein geeignetes Kultursystem zur sicheren Ernte von Embryonen in das Blastozystenstadium von entscheidender Bedeutung für die Umsetzung der TE-Biopsiestrategie. Eine ausreichende Anzahl von Inkubatoren sowie die Verwendung von geringer Sauerstoffspannung sind wichtige Voraussetzungen dafür, um die Blastozystenrate9nicht zu gefährden. Gleichzeitig wird ein effizientes Kryokonservierungsprogramm benötigt, um einen PGT-Zyklus sicher zu verwalten. In den letzten zehn Jahren hat die Umsetzung der Vitrifizierung die Kryoüberlebensraten in Embryonen sogar auf >99%10,11erhöht. Dies bot genügend Zeit, um genetische Tests durchzuführen und den Embryotransfer auf den folgenden Menstruationszyklus auf ein nicht stimuliertes und wahrscheinlich empfänglicheres Endometrium zu verschieben12.
Sowohl die TE-Biopsie als auch die Verglasung sind anspruchsvolle Aufgaben, die strenge Fähigkeiten erfordern, und ihre Wirksamkeit kann von unerfahrenen Bedienern unterschiedlich sein. Daher wird eine spezifische Ausbildungszeit empfohlen, bevor es jedem Bediener gestattet wird, diese Verfahren klinisch durchzuführen; Darüber hinaus sollte die Aufrechterhaltung der Fähigkeiten der Betreiber regelmäßig durch die Überwachung der Leistungskennzahlen (KPI) für Kryokonservierungs- und Biopsieverfahren bewertet werden. Jede IVF-Klinik sollte zu diesem Zweck interne KPIs festlegen, die sich den von internationalen Konsortien veröffentlichten KPIs und/oder den von Referenzlaboratorien veröffentlichten Ergebnissen annähern müssen.
TE-Biopsie-, Verglasungs-Erwärmungs- und Zeugenverfahren sind validierte Techniken in unserer Einheit, die auf alle beteiligten Akteure standardisiert wurden, wie in drei früheren Veröffentlichungen berichtet11,13,14 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Nur erfahrene erfahrene Embryologen, die ihre Ausbildung abgeschlossen haben, sollten sowohl TE-Biopsie als auch Blastozysten-Vitrifikation durchführen. Darüber hinaus ist ein Zeuge verpflichtet, die Verfahren zu überwachen und eine effiziente Rückverfolgbarkeit während i) der Bewegungen der biopsied Blastozyste von der Biopsieschale(Zusatzabbildung 1) zur Nachbiopsieschale (Zusatzabbildung 1) zu gewährleisten. ), dann zur Verglasungsplatte (Zusatzabbildung 1) und …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AG und RM sammelten die Daten und verfassten das Manuskript. DC analysierte die Daten, erstellte die repräsentativen Ergebnisse, führte die Statistiken durch und überarbeitete das Manuskript. FMU und LR lieferten eine kritische Diskussion über die Ergebnisse und das gesamte Manuskript.
Materials
| Equipment | |||
| Cold tube rack | Biocision | XTPCR96 | |
| Electronic pipette controller | Fisher Scientific | 710931 | |
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | 66003 | p20 |
| IVF Electronic Witness System | CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions | RI Witness ART Management System | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Laser objective | RI | Saturn 5 | |
| Microinjectors | Nikon Narishige | NT-88-V3 | |
| Mini centrifuge for PCR tubes | Eppendorf | CSLQSPIN | for 0.2ml PCR tubes |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Thermostat | Panasonic | MCO-5AC-PE | |
| Tri-gas incubator | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
| Consumables | |||
| Biopsy pipette | RI | 7-71-30FB35720 | 30µm ID, flat 35°C |
| Cryolock | Cryolock | CL-R-CT | |
| CSCM complete | Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
| Embryo Transfer Catheter | Cook | G17934 | |
| Flexipet pipette | Cook | G26712 | 140µm stripping pipette tip |
| Flexipet pipette | Cook | G46020 | 300µm stripping pipette tips |
| Holding pipette | RI | 7-71-IH35/20 | 30µm ID, flat 35°C |
| Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 9988 | |
| IVF One well dish | Falcon | 353653 | |
| Mineral Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Modified HTF Medium | Irvine Scientific | 90126 | Hepes-Buffered medium |
| Nuclon Delta Surface | Thermofisher scientific | 176740 | IVF dish 4-well plate with sliding lid |
| Primaria Cell culture dish | Corning | 353802 | 60x15mm |
| Reproplate | Kitazato | 83016 | |
| Serological pipette | Falcon | 357551 | 10ml |
| Sterile disposable Gilson tips | Eppendorf | 0030 075.021 | 200µl |
| Tubing Kit | Provided by the genetic lab | PCR tubes (0.2mL), loading solution, biopsy washing solution | |
| Vitrification media | Kitazato | VT801 | Equilibration and vitrification solutions |
| Warming media | Kitazato | VT802 | Thawing and dilution solutions |
Referencias
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