ヒト胚盤胞生検とガラス化
Summary
胚盤胞生検およびガラス化は、移植前遺伝子検査を効率的に行うために必要とされる。5-7日目のゾナ・ペルシダの順次開きと7-8型栄養細胞の検索を伴うアプローチは、必要な操作の数と、最適でない環境条件への胚の暴露の両方を制限する。
Abstract
胚盤胞生検は、移植前遺伝子検査を伴うIVFサイクル中に信頼性の高い遺伝子診断を得るために行われる。次に、理想的なワークフローは、診断技術のターンアラウンドタイムに起因する安全で効率的なガラス化プロトコルを伴い、選択した胚を以下の自然サイクルで生理学的子宮内膜上に移す。ゾーナ・ペルシダの順次開きと5-10型血球細胞の検索(理想的には7-8)を包含する生検アプローチは、必要な操作の数と胚の暴露の両方を最適でない環境条件に制限する。適切なトレーニングの後、この技術は、生検のタイミング(約8分、1皿当たりの生検に基づく胚数に基づく3〜22分の範囲)、決定的な診断(約97.5%)の点で、異なるオペレータ間で再現可能であった。ガラス化された温められたユープロイド胚盤胞転移後の出生率(>40%)。生検、ガラス化および温暖化後の生存率は99.8%と高かった。温暖化から1.5時間での再膨張率は97%と高く、生検とガラス化(理想的には≤30分)、胚盤胞形態の質および生検の日の間のタイミングに大きく依存した。一般に、崩壊した胚盤胞を活性化する方が良い。したがって、非PGTサイクルでは、レーザー支援人工収縮が凍結保存前に胚の崩壊を誘発するために行われる可能性がある。最も有望な将来の視点は、胚性DNAの移植源としての胚盤胞培養後のIVF培養培地の非侵襲的分析である。しかし、この潜在的な前衛的な可能性はまだ調査中であり、信頼性の高いプロトコルを定義し、検証する必要があります。
Introduction
現代の人間発生学の主な目標は、刺激されたサイクルあたりの出生数を最大化し、妊娠を達成するためのコスト、時間、努力を削減することです。この目標を達成するためには、IVFサイクル中に得られたコホート内の生殖能力のある胚を同定するために、胚選択のための検証されたアプローチを採用すべきである。最新の証拠によると、胚盤胞培養1は、包括的な染色体試験およびガラス化温温化胚移植(ET)と組み合わされ、IVF効率を高めるための最も効率的なフレームワーク2である。明らかに、無気力検査は胚標本を必要とし、現在のところ、現在は、妊娠中に胚附属書(例えば、胎盤)に起源を与える胚盤胞のセクションから取り出される少数の細胞から主に表される。.核型解析を超えて、単一遺伝子変異も、移植前遺伝子検査(PGT;-A、構造染色体再配列のための-SR、単原性疾患の-M)として知られている臨床戦略の一部としてTE生検から評価される可能性があります。他の卵母細胞/胚生検法は、過去数十年にわたって理論的に採用され、すなわち極性体生検および胚盤胞生検を採用している。しかし、その手続き上の欠点(例えば、より高いワークロードと生殖への影響のリスク)と診断の制限(例えば、単一細胞分析の問題)が暗黙的にコスト、リスクとリスクの間の十分なバランスを妨げるので、その使用は、今日では減少しています。利点 (レビューについては、3を参照してください)。
本論文では、TE生検の主なプロトコルの1つを、その後のガラス化、温暖化および転送手順と共に徹底的に説明する。ここで概説されているワークフローは、ビジーな PGT ユニットに最適です。
我々のグループ4、5によって既に述べたように、手順は完全に膨張した胚盤胞のゾナ・ペルシダの逐次開きおよび少数のTE細胞の除去を含む(平均7-8)。3日目のレーザーアシストハッチングベースの胚盤胞生検法6と比較して、この手順は、胚盤胞生検やガラス化などの繊細な手順をタイムリーに行わなければならないIVFユニットの毎日のスケジュールを容易にする可能性があります。胚盤胞が完全な拡張に達するとすぐに、生検は除去するTE細胞を選択することによって行うことができ、それによって内細胞塊(ICM)のヘルニアのリスクを防ぎ、それ以外の場合は手順を困難にするであろう。文献では、胚盤胞生検の第3のプロトコルも記載されており、これは、胚が既に胚盤胞期に達した後に行われるレーザー支援孵化を伴い、手順5、7の数時間前に行われる。しかし、このアプローチはより時間がかかり、主に経験豊富なオペレータの手にTE生検を実装しているIVFユニットに適しており、適度に低い毎日のワークロードを考慮しています。
細胞内血漿中精子注射(ICSI)8は、IVFで遺伝子解析を行うことを目指す場合の統合技術であるべきである。同様に、胚盤胞段階に胚を安全に収穫するための適切な培養システムは、TE生検戦略の実施にとって極めて重要である。十分な数のインキュベーター、ならびに低酸素張力の使用は、この目的のために重要な前提条件であり、胚盤胞率9を損なわない。同時に、PGTサイクルを安全に管理するためには、効率的な凍結保存プログラムが必要です。過去10年間で、ガラス化の実施は、胚の凍結生存率を最大>99%10、11まで高めました。これは、遺伝子検査を行い、次の月経周期への胚移植を延期するのに十分な時間を提供し、非刺激的でおそらくより受容性の子宮内膜12に。
TE生検とガラス化の両方が厳しいスキルを必要とするタスクを要求しており、その有効性は経験の浅いオペレータによって異なる可能性があります。したがって、特定のトレーニング期間は、各オペレータが臨床的にこれらの手順を実行できるようにする前に提唱されます。さらに、凍結保存および生検手順の主要業績評価指標(KPI)を監視することにより、オペレータのスキルの維持を定期的に評価する必要があります。各IVFクリニックは、この目的に内部KPIを設定する必要があり、これは国際コンソーシアムによって公開されたものや参照ラボによって発表された結果を概算する必要があります。
TE生検、ガラス化温暖化および目撃手順は、3つの以前の出版物11、13、14で報告されているように関与するすべてのオペレータ間で標準化された私達の単位で検証された技術である。.
Protocol
Representative Results
Discussion
訓練期間を修了した経験豊富な熟練した胚学者のみが、TE生検と胚盤胞ガラス化の両方を行う必要があります。さらに、生検皿(補助図1)から生検後皿への生検胚盤胞の動き(補足図1)の手順を監視し、効率的なトレーサビリティを保証するために証人が必要です(補足図1))、次にガラス化プレート(補足図1)に、最後にガラス化支持体(補足図1)へ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AGとRMはデータを収集し、原稿を作成しました。DCはデータを分析し、代表的な結果を起草し、統計を行い、原稿を改訂した。FMUとLRは、結果と原稿全体の批判的な議論を提供しました。
Materials
| Equipment | |||
| Cold tube rack | Biocision | XTPCR96 | |
| Electronic pipette controller | Fisher Scientific | 710931 | |
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | 66003 | p20 |
| IVF Electronic Witness System | CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions | RI Witness ART Management System | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Laser objective | RI | Saturn 5 | |
| Microinjectors | Nikon Narishige | NT-88-V3 | |
| Mini centrifuge for PCR tubes | Eppendorf | CSLQSPIN | for 0.2ml PCR tubes |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Thermostat | Panasonic | MCO-5AC-PE | |
| Tri-gas incubator | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
| Consumables | |||
| Biopsy pipette | RI | 7-71-30FB35720 | 30µm ID, flat 35°C |
| Cryolock | Cryolock | CL-R-CT | |
| CSCM complete | Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
| Embryo Transfer Catheter | Cook | G17934 | |
| Flexipet pipette | Cook | G26712 | 140µm stripping pipette tip |
| Flexipet pipette | Cook | G46020 | 300µm stripping pipette tips |
| Holding pipette | RI | 7-71-IH35/20 | 30µm ID, flat 35°C |
| Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 9988 | |
| IVF One well dish | Falcon | 353653 | |
| Mineral Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Modified HTF Medium | Irvine Scientific | 90126 | Hepes-Buffered medium |
| Nuclon Delta Surface | Thermofisher scientific | 176740 | IVF dish 4-well plate with sliding lid |
| Primaria Cell culture dish | Corning | 353802 | 60x15mm |
| Reproplate | Kitazato | 83016 | |
| Serological pipette | Falcon | 357551 | 10ml |
| Sterile disposable Gilson tips | Eppendorf | 0030 075.021 | 200µl |
| Tubing Kit | Provided by the genetic lab | PCR tubes (0.2mL), loading solution, biopsy washing solution | |
| Vitrification media | Kitazato | VT801 | Equilibration and vitrification solutions |
| Warming media | Kitazato | VT802 | Thawing and dilution solutions |
Referencias
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