Biopsia y vitrificación de blastocisto humano
Summary
La biopsia de blastocisto y la vitrificación son necesarias para realizar pruebas genéticas preimplantacionales de manera eficiente. Un enfoque que implica la apertura secuencial de la zona pellucida y la recuperación de 7-8 células de trophectoderm en el día 5-7 post-inseminación limita tanto el número de manipulaciones requeridas como la exposición del embrión a condiciones ambientales subóptimas.
Abstract
La biopsia de blastocisto se realiza para obtener un diagnóstico genético fiable durante los ciclos de FIV con pruebas genéticas preimplantacionales. A continuación, el flujo de trabajo ideal implica un protocolo de vitrificación seguro y eficiente, debido al tiempo de respuesta de las técnicas de diagnóstico y para transferir el embrión o embriones seleccionados en un endometrio fisiológico en un siguiente ciclo natural. Un enfoque de biopsia que abarca la apertura secuencial de la zona pellucida y la recuperación de 5-10 células de trophectoderm (idealmente 7-8) limita tanto el número de manipulaciones requeridas como la exposición del embrión a condiciones ambientales subóptimas. Después del entrenamiento adecuado, la técnica fue reproducible entre diferentes operadores en términos de sincronización de la biopsia (8 min, que van 3-22 min en función del número de embriones a biopsia por plato), diagnósticos concluyentes obtenidos (97,5%) y las tasas de nacimientos vivos después de la transferencia de blastocisto euploide vitriloide (>40%). La tasa de supervivencia después de la biopsia, vitrificación y calentamiento fue tan alta como 99.8%. La tasa de reexpansión a 1,5 h del calentamiento fue tan alta como 97%, dependiendo en gran medida del momento entre la biopsia y la vitrificación (idealmente 30 min), la calidad morfológica del blastocisto y el día de la biopsia. En general, es mejor vitrifiar un blastocisto colapsado; por lo tanto, en ciclos no-PGT, la contracción artificial asistida por láser podría realizarse para inducir el colapso embrionario antes de la criopreservación. La perspectiva de futuro más prometedora es el análisis no invasivo de los medios de cultivo de FIV después del cultivo del blastocisto como fuente putativa de ADN embrionario. Sin embargo, esta vanguardia potencial todavía está en investigación y todavía es necesario definir y validar un protocolo fiable.
Introduction
El objetivo principal de la embriología humana moderna es maximizar el número de nacimientos vivos por ciclo estimulado y reducir los costos, el tiempo y los esfuerzos para lograr un embarazo. Para lograr este objetivo, se deben emplear enfoques validados para la selección de embriones para identificar embriones reproductivos competentes dentro de una cohorte obtenida durante un ciclo de FIV. Según las últimas pruebas, el cultivo de blastocisto1 combinado con pruebas cromosómicas exhaustivas y transferencia de embriones euploide (ET) calentada vitrificada es el marco más eficiente para aumentar la eficiencia de la FIV2. Claramente, las pruebas de aneuploidía requieren un espécimen embrionario, que en la actualidad se representa principalmente a partir de pocas células recuperadas del trophectoderrm (TE), es decir, la sección del blastocisto que da origen a los anexos embrionarios (por ejemplo, la placenta) durante el embarazo . Más allá del análisis del cariotipo, también se podrían evaluar mutaciones genéticas únicas a partir de una biopsia TE como parte de una estrategia clínica conocida como pruebas genéticas preimplantacionales (PGT; -A para aneuploidías, -SR para reordenamientos cromosómicos estructurales, -M para enfermedades monogénicas). Otros métodos de biopsia de ovocitos/embriones han sido teorizados y adoptados clínicamente a lo largo de las últimas décadas, a saber, biopsia de cuerpos polares y biopsia de blastomero. Sin embargo, su uso se reduce hoy en día, ya que sus inconvenientes procesales (por ejemplo, mayor carga de trabajo y riesgo de impacto reproductivo) y las limitaciones diagnósticas (por ejemplo, cuestiones de análisis de una sola célula) obstaculizan implícitamente un equilibrio suficiente entre los costos, los riesgos y beneficios (para una revisión ver3).
En este artículo, uno de los principales protocolos para la biopsia de TE se describe a fondo junto con los procedimientos posteriores de vitrificación, calentamiento y transferencia requeridos. El flujo de trabajo aquí descrito es ideal para una unidad PGT ocupada.
Como ya ha descrito anteriormente nuestro grupo4,5, el procedimiento implica la apertura secuencial de la zona pellucida de blastocistos completamente expandidos y la eliminación de pocas células TE (en promedio 7-8). En comparación con el método de biopsia de blastocisto basada en el sombreado asistida por láserdeldía 3, este procedimiento podría facilitar el horario diario de una unidad de FIV donde se deben realizar oportunamente procedimientos delicados, como la biopsia de blastocisto y la vitrificación. Tan pronto como el blastocisto alcanza su expansión completa, la biopsia se puede llevar a cabo seleccionando las células TE para extraer, evitando así el riesgo de hernia de la masa celular interna (ICM), lo que de otra manera haría que el procedimiento fuera un reto. En la literatura, también se ha descrito un tercer protocolo de biopsia de blastocisto, que implica la eclosión asistida por láser que se realiza una vez que el embrión ya ha alcanzado la etapa de blastocisto, pocas horas antes del procedimiento5,7. Sin embargo, este enfoque consume más tiempo y se adapta principalmente a las unidades de FIV que están implementando la biopsia TE en manos de operadores con experiencia limitada y en vista de una carga de trabajo diaria moderada-baja.
La inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI)8 debe ser una técnica consolidada si se trata de realizar análisis genéticos en ficticia. Del mismo modo, un sistema de cultivo adecuado para cosechar embriones de forma segura en la etapa de blastocisto es crucial para la implementación de la estrategia de biopsia TE. Un número adecuado de incubadoras, así como el uso de baja tensión de oxígeno son requisitos previos clave para este fin, no comprometer la tasa de blastocisto9. Al mismo tiempo, se necesita un programa de criopreservación eficiente para gestionar de forma segura un ciclo de PGT. En la última década, la implementación de la vitrificación ha impulsado las tasas de criosupervivencia embrionaria hasta >99%10,11. Esto proporcionó tiempo suficiente para realizar pruebas genéticas y posponer la transferencia de embriones al siguiente ciclo menstrual, en un endometrio no estimulado y probablemente más receptivo12.
Tanto la biopsia de TE como la vitrificación son tareas exigentes que requieren habilidades estrictas y su eficacia puede variar entre operadores sin experiencia. Por lo tanto, se aboga un período de formación específico antes de permitir que cada operador realice estos procedimientos clínicamente; además, el mantenimiento de las habilidades de los operadores debe evaluarse periódicamente mediante el seguimiento de indicadores clave de rendimiento (KPI) para los procedimientos de criopreservación y biopsia. Cada clínica de FIV debe establecer KPI internos para este fin, que deben aproximarse a los publicados por consorcios internacionales y/o los resultados publicados por los laboratorios de referencia.
La biopsia TE, el calentamiento de la vitrificación y los procedimientos de testimonio son técnicas validadas en nuestra unidad, que se han estandarizado en todos los operadores involucrados según se informó en tres publicaciones anteriores11,13,14 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Sólo los embriólogos experimentados que hayan completado su período de entrenamiento deben realizar tanto la biopsia TE como la vitrificación del blastocisto. Además, se requiere un testigo para monitorear los procedimientos y garantizar una trazabilidad eficiente durante i) los movimientos del blastocisto biopsiado desde la antena de biopsia (FiguraSuplementaria 1) a la antena post-biopsia (FiguraSuplementaria 1 ), a continuación a la placa de vitrificación (Figurasupleme…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AG y RM recopilaron los datos y redactaron el manuscrito. DC analizó los datos, redactó los resultados representativos, realizó las estadísticas y revisó el manuscrito. FMU y LR proporcionaron una discusión crítica de los resultados y de todo el manuscrito.
Materials
| Equipment | |||
| Cold tube rack | Biocision | XTPCR96 | |
| Electronic pipette controller | Fisher Scientific | 710931 | |
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | 66003 | p20 |
| IVF Electronic Witness System | CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions | RI Witness ART Management System | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Laser objective | RI | Saturn 5 | |
| Microinjectors | Nikon Narishige | NT-88-V3 | |
| Mini centrifuge for PCR tubes | Eppendorf | CSLQSPIN | for 0.2ml PCR tubes |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Thermostat | Panasonic | MCO-5AC-PE | |
| Tri-gas incubator | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
| Consumables | |||
| Biopsy pipette | RI | 7-71-30FB35720 | 30µm ID, flat 35°C |
| Cryolock | Cryolock | CL-R-CT | |
| CSCM complete | Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
| Embryo Transfer Catheter | Cook | G17934 | |
| Flexipet pipette | Cook | G26712 | 140µm stripping pipette tip |
| Flexipet pipette | Cook | G46020 | 300µm stripping pipette tips |
| Holding pipette | RI | 7-71-IH35/20 | 30µm ID, flat 35°C |
| Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 9988 | |
| IVF One well dish | Falcon | 353653 | |
| Mineral Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Modified HTF Medium | Irvine Scientific | 90126 | Hepes-Buffered medium |
| Nuclon Delta Surface | Thermofisher scientific | 176740 | IVF dish 4-well plate with sliding lid |
| Primaria Cell culture dish | Corning | 353802 | 60x15mm |
| Reproplate | Kitazato | 83016 | |
| Serological pipette | Falcon | 357551 | 10ml |
| Sterile disposable Gilson tips | Eppendorf | 0030 075.021 | 200µl |
| Tubing Kit | Provided by the genetic lab | PCR tubes (0.2mL), loading solution, biopsy washing solution | |
| Vitrification media | Kitazato | VT801 | Equilibration and vitrification solutions |
| Warming media | Kitazato | VT802 | Thawing and dilution solutions |
Referencias
- Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology. Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118 (2016).
- Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: a meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
- Cimadomo, D., et al. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. Biomedical Research International. 2016, 7193075 (2016).
- Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
- Capalbo, A., et al. Implementing PGD/PGD-A in IVF clinics: considerations for the best laboratory approach and management. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. , (2016).
- McArthur, S. J., Leigh, D., Marshall, J. T., de Boer, K. A., Jansen, R. P. Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts. Fertility and Sterility. 84 (6), 1628-1636 (2005).
- Kokkali, G., et al. Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major. Human Reproduction. 20 (7), 1855-1859 (2005).
- Rienzi, L., Ubaldi, F., Anniballo, R., Cerulo, G., Greco, E. Preincubation of human oocytes may improve fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13 (4), 1014-1019 (1998).
- Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- Cimadomo, D., et al. Associations of blastocyst features, trophectoderm biopsy and other laboratory practice with post-warming behavior and implantation. Human Reproduction. , (2018).
- Evans, J., et al. Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence. Human Reproduction Update. 20 (6), 808-821 (2014).
- Capalbo, A., et al. Consistent and reproducible outcomes of blastocyst biopsy and aneuploidy screening across different biopsy practitioners: a multicentre study involving 2586 embryo biopsies. Human Reproduction. 31 (1), 199-208 (2016).
- Cimadomo, D., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during PGD/PGS cycles. Reproductive Biomedicine Online. 33 (3), 360-369 (2016).
- Gardner, D. K., Schoolcraft, B., Jansen, R., Mortimer, D. . Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999. , 377-388 (1999).
- Cimadomo, D., et al. Inconclusive chromosomal assessment after blastocyst biopsy: prevalence, causative factors and outcomes after re-biopsy and re-vitrification. A multicenter experience. Human Reproduction. , (2018).
- de Boer, K. A., Catt, J. W., Jansen, R. P., Leigh, D., McArthur, S. Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF. Fertility and Sterility. 82 (2), 295-298 (2004).
- Capalbo, A., Rienzi, L. Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass. Fertility and Sterility. 107 (5), 1098-1106 (2017).
- McCoy, R. C., et al. Evidence of Selection against Complex Mitotic-Origin Aneuploidy during Preimplantation Development. PLoS Genetics. 11 (10), e1005601 (2015).
- Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
- Lee, H., et al. Live births after transfer of rebiopsy and revitrification of blastocyst that had “no diagnosis” following trophectoderm biopsy. Fertility and Sterility. 106 (3), e164 (2016).
- Capalbo, A., et al. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
- Hammond, E. R., Shelling, A. N., Cree, L. M. Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use. Human Reproduction. 31 (8), 1653-1661 (2016).
- Vera-Rodriguez, M., et al. Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development. Human Reproduction. 33 (4), 745-756 (2018).
