In vitro assay om tumor-macrofaag interactie te bestuderen

Summary

Dit artikel is een nuttige in vitro assay om het vermogen van geconditioneerd medium van tumorcellen te evalueren om macrofagen aan te trekken.

Abstract

Tumor geassocieerde macrofagen (TAMs) rekening voor een groot percentage van de cellen in de tumor massa voor verschillende soorten kankers. Glioblastoma (GBM), een kwaadaardige hersentumor zonder genezing, heeft tot een halve tumor massa TAMs. TAMs kan Pro-tumoreel of anti-tumoreel zijn, afhankelijk van de activering van specifieke genen in de cellen. Genetische mutaties in de tumoren, door het reguleren van cytokine expressie, kan invloed hebben op de werving van TAMs aan de tumor micro omgeving. Hier beschrijven we een kwantitatieve cel-gebaseerde assay om macrofaag Recruitment te beoordelen door het geconditioneerde medium uit de tumorcellen. Deze test gebruikt de humane macrofaag cellijn MV-4-11 om macrofaag aantrekking te bestuderen door het geconditioneerde medium van glioblastoma, wat een hoge reproduceerbaarheid en een lage variabiliteit mogelijk maakt. Gegevens die met deze test worden gegenereerd, kunnen bijdragen tot een beter begrip van de interactie tussen de tumor en de tumor microomgeving. Vergelijkbare assay kan worden gebruikt voor het beoordelen van de interactie tussen de tumorcellen en andere immuuncellen, met inbegrip van T-cellen en Natural Killer (NK) cellen.

Introduction

Macrofagen zijn immuuncellen met hoge fenotypische en functionele heterogeniteit¹. Ze spelen belangrijke rollen in de host Defense Systems, weefsel reparatie, ontwikkeling en tumorprogressie¹. TAMs zijn macrofagen in de micro-omgeving van vaste tumoren. Bepaalde TAMS kan bevorderen tumorgroei door remming van T-cel gemedieerde cytotoxische activiteit, moduleren van de tumor micro Environment (TME), bevordering van angiogenese, invasie en metastase^{2,3,4, 5}. TAMS behoren tot de meest overvloedige celtypen in de TME en een hoger aantal TAMS in het algemeen correleert met een slechtere overleving van de patiënt in vele soorten vaste tumoren⁶. De verschillende genetische handtekeningen van de tumorcellen beïnvloeden hun vermogen om macrofagen te rekruteren. In GBM, een agressieve hersentumor zonder genezing, macrofagen kunnen vertegenwoordigen tot een helft van de tumor massa⁷. Co-amplificatie van de epidermale groeifactor receptor (EGFR) en de afkapping Mutant egfrviii wordt vaak waargenomen in GBM, waardoor tumorgroei voordelen⁸. Cellen die gezamenlijk EGFR en EGFRvIII uitdrukken, trekken meer macrofagen aan dan cellen die EGFR of EGFRvIII afzonderlijk⁷uitdrukken.

Chemokines zijn een familie van kleine cytokinen die belangrijke rol spelen bij het reguleren van immune samenstelling in de TME^6,9. Menselijke cellen Express meer dan 50 cytokines¹⁰. Immuun infiltratie in de tumoren wordt grotendeels gerealiseerd door de interactie tussen cytokines en cytokine receptoren¹¹. Elk type immuuncellen spreekt uitgesproken Chemokine receptoren/chemokines en kan worden gerekruteerd door cellen die specifieke chemokines/Chemokine receptoren¹²afscheidende. Kankercellen kunnen de expressie van bepaalde chemokinen verhogen om immuuncellen te rekruteren, zoals TAMs, regulatoire T-cellen en myeloïde afgeleide suppressor cellen (MDSCs)⁶. Blokkade van specifieke Chemokine uitgescheiden door de tumoren kan een veelbelovende manier in remming van infiltratie van immune cellen in de tumor massa.

Hier, we beschrijven een protocol dat toelaat in vitro evaluatie van tumor-macrofaag interactie, met behulp van geconditioneerde media uit de tumorcellen met chemokines en macrofaag cellijnen.

Protocol

1. middelgrote voorbereiding Bereiding van het serum vrije stamcel medium Ontdooit het 50x B27 supplement, de epidermale groeifactor (EGF, 20 μg/mL in 10 mM azijnzuur met 0,1% BSA), en de fibroblast-groeifactor (FGF, 20 μg/mL in 10 mM azijnzuur met 0,1% BSA). Voeg 500 μL EFG (eindconcentratie 20 ng/mL), 500 μL FGF (eindconcentratie 20 ng/mL), 10 mL 50x B27 tot 500 mL van Dulbecco’s gemodificeerde Eagle medium/nutriënt mengsel F-12 (DMEM/F12) en 5 mL 100x Penicillaire/…

Representative Results

De resultaten worden meestal getoond via staafdiagrammen (voorbeeld weergegeven in Figuur 1). Monsters met hoge 480/520-waarden geven aan dat de geconditioneerde media een hoge capaciteit hebben om macrofagen te werven. Afhankelijk van de experimentele behoefte kunnen extra bedieningselementen worden opgenomen. Zo kan men neutraliserende antilichamen gebruiken om de geconditioneerde media te behandelen om de macrofaag chemotaxis af te schaffen en dezelfde tes…

Discussion

In dit protocol zijn er verschillende belangrijke stappen: 1) selectie van de trans well insert. Voor de MV-4-11 cellijn werken 5 μm trans well inserts goed. Voor andere cellijnen zoals de veelgebruikte monocyt cellijn thp-1 kan een andere poriegrootte echter beter werken. 2) omdat verschillende cellijnen met verschillende snelheden groeien, is het belangrijk om het volume van de geconditioneerde media aan te passen aan de celaantallen. Hiertoe kunnen cellen vrije media die onder dezelfde experimentele omstandigheden wo…

Materials

0.1 μm filtration cup	Thermo fisher	566-0010
0.45 μm filter unit	Millipore	SLHA033SS
10 mL serological pipettes	Olympus plastics	12-104
15mL sterile centrifuge tubes	Olympus plastics	28-103
1 mL pipette tip	ART molecular bioproducts	2779-RI
2 mL aspirating pipet	Falcon	357558
24-well plate	Millipore	ECM507	Part of ECM507, or can be purchased separately
4x lysis buffer	Millipore	ECM507	Part of ECM507, or can be purchased separately
5 μm Transwell insert	Millipore	ECM507	Part of ECM507, or can be purchased separately
75cm2 flask	Corning	430641U
Accutase	Innovative cell technologies	AT-104
B27	Gibco	12587-010
CyQuant Dye	Millipore	ECM507	Part of ECM507, or can be purchased separately
DMEM	Gibco	11965-092
DMEM:F12	Gibco	10565-018
EGF	Peprotech	AF-100-15
FBS	Gibco	26140
FGF	Peprotech	100-18B
IMDM	Gibco	12440-053
PBS	Gibco	14190-144
Pen Strep	Gibco	15140-122
Trypan blue	Biorad	1450021