腫瘍マクロファージ相互作用を研究するインビトロアッセイ
Summary
この記事は、マクロファージを引き付けるために腫瘍細胞から条件付き培地の能力を評価するのに有用なインビトロアッセイを表す。
Abstract
腫瘍関連マクロファージ(TAM)は、異なるタイプの癌に対する腫瘍塊の細胞の大部分を占める。神経膠芽腫(GBM)は、治療法のない悪性脳腫瘍であり、腫瘍塊の半分までである。TAMは、細胞内の特定の遺伝子の活性化に応じて、腫瘍前または抗腫瘍でありうたることができる。腫瘍における遺伝的変異は、サイトカイン発現を調節することにより、腫瘍微小環境へのAMの募集に影響を与える可能性がある。ここでは、腫瘍細胞からの条件付き培地によるマクロファージ募集を評価する定量的細胞ベースアッセイについて説明する。このアッセイは、ヒトマクロファージ細胞株MV-4-11を用いて、神経膠芽腫からの条件付き培地によるマクロファージの引力を研究し、高い再現性と低変動性を可能にする。このアッセイで生成されたデータは、腫瘍と腫瘍微小環境との相互作用のより良い理解に寄与することができる。同様のアッセイは、T細胞およびナチュラルキラー(NK)細胞を含む腫瘍細胞と他の免疫細胞との相互作用を評価するために使用することができる。
Introduction
マクロファージは、高い催奇形性と機能的不均一性1を有する免疫細胞である。彼らは宿主防衛システム、組織修復、発達および腫瘍進行1で重要な役割を果たす。TAMは固形腫瘍の微小環境におけるマクロファージである。特定のTAmは、T細胞媒介性細胞傷害活性を阻害し、腫瘍微小環境(TME)を調節し、血管新生、侵来および転移を促進することを通じて腫瘍増殖を促進することができる2、3、4、5.TMEはTMEの中で最も豊富な細胞型の一つであり、より多くのTAMは一般的に多くのタイプの固形腫瘍6の悪い患者生存と相関する。腫瘍細胞の明確な遺伝的特徴は、マクロファージを募集する能力に影響を与える。GBMでは、治療法のない積極的な脳腫瘍では、マクロファージは腫瘍質量7の半分まで表すことができる。表皮成長因子受容体(EGFR)とその切り捨て変異体EGFRvIIIの共増幅は、腫瘍成長の利点を付与するGBMで頻繁に観察され、8.EGFRおよびEGFRvIIIを共発現する細胞は、EGFRまたはEGFRvIIIを一人で7を発現する細胞と比較してより多くのマクロファージを引き付ける。
ケモカインは、TME6,9における免疫組成の調節に重要な役割を果たす小さなサイトカインのファミリーである。ヒト細胞は50以上のサイトカイン10を発現する。腫瘍における免疫浸潤は、サイトカインとサイトカイン受容体11との相互作用によって大きく実現される。免疫細胞の各タイプは、異なるケモカイン受容体/ケモカイン受容体を発現し、特定のケモカイン/ケモカイン受容体12を分泌する細胞によって募集することができる。癌細胞は、TAM、調節性T細胞および骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)6などの免疫細胞を募集する特定のケモカインの発現を増加させることができる。腫瘍によって分泌される特異的ケモカインの遮断は、腫瘍塊への免疫細胞の浸潤を阻害する有望な方法であり得る。
ここでは、ケモカインおよびマクロファージ細胞株を含む腫瘍細胞からの条件付き培養媒体を用いて、腫瘍マクロファージ相互作用のインビトロ評価を可能にするプロトコルについて説明する。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、いくつかの重要なステップがあります:1)トランスウェルインサートの選択。MV-4-11細胞株の場合、5μmトランスウェルインサートはうまく機能します。しかし、一般的に使用される単球細胞株THP-1のような他の細胞株の場合、異なる細孔サイズがより良く働くかもしれません。2)異なる細胞株が異なる速度で成長するにつれて、セル番号に応じて条件付き媒体の体積を調整?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
助成金:Z.Aは、アレックスのレモネードスタンド財団、米国脳腫瘍協会、NIH T32CA108462、サンドラー財団が部分的に資金提供している画期的な生物医学研究プログラムから支援を受けました。W. ワイスは、NIH助成金R01CA221969、R01NS091620、P50CA097257、U01CA217864、P30CA82103によってサポートされました。サミュエル・G・ワックスマン癌研究財団;そして、エブリンとマッティ・アンダーソン・チェア。
Materials
| 0.1 μm filtration cup | Thermo fisher | 566-0010 | |
| 0.45 μm filter unit | Millipore | SLHA033SS | |
| 10 mL serological pipettes | Olympus plastics | 12-104 | |
| 15mL sterile centrifuge tubes | Olympus plastics | 28-103 | |
| 1 mL pipette tip | ART molecular bioproducts | 2779-RI | |
| 2 mL aspirating pipet | Falcon | 357558 | |
| 24-well plate | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| 4x lysis buffer | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| 5 μm Transwell insert | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| 75cm2 flask | Corning | 430641U | |
| Accutase | Innovative cell technologies | AT-104 | |
| B27 | Gibco | 12587-010 | |
| CyQuant Dye | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 10565-018 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| FGF | Peprotech | 100-18B | |
| IMDM | Gibco | 12440-053 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypan blue | Biorad | 1450021 |
Referencias
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