Generierung eines Rattenmodells für akutes Leberversagen durch Kombination von 70% partieller Hepatektomie und Acetaminophen
Summary
Das in der aktuellen Studie entwickelte Modell für akutes Leberversagen stellt eine praktikable Alternative zur Untersuchung potenzieller Therapien dar. Das aktuelle Modell nutzt die kombinierte Wirkung von körperlichen und drogeninduzierten Leberverletzungen und bietet ein geeignetes Zeitfenster, um das Potenzial neuartiger Therapien zu untersuchen.
Abstract
Akutes Leberversagen (ALF) ist ein klinischer Zustand, der durch verschiedene Ätiologien verursacht wird, was zum Verlust von metabolischen, biochemischen, synthetisierenden und entgiftenden Funktionen der Leber führt. In den meisten irreversiblen Leberschäden, orthotrope Lebertransplantation (OLT) bleibt die einzige verfügbare Behandlung. Um das therapeutische Potenzial einer Behandlung für ALF zu untersuchen, ist ihre vorherige Prüfung in einem Tiermodell von ALF unerlässlich. In der aktuellen Studie wurde ein ALF-Modell bei Ratten entwickelt, indem 70% partielle Hepatectomie (PHx) und Injektionen von Acetaminophen (APAP) kombiniert wurden, das ein therapeutisches Fenster von 48 h bietet. Die medianen und linken seitlichen Lappen der Leber wurden entfernt, um 70% der Lebermasse zu verbrauchen und APAP wurde 24 h postchirurgisch für 2 Tage gegeben. Das Überleben bei ALF-induzierten Tieren wurde als stark verringert. Die Entwicklung von ALF wurde durch veränderte Serumspiegel der Enzyme Alanin-Aminotransferase (ALT), Aspartat-Aminotransferase (AST), alkalische Phosphatase (ALP); Veränderungen der Prothrombinzeit (PT); und Bewertung des international normalisierten Verhältnisses (INR). Die Untersuchung des Genexpressionsprofils durch qPCR ergab einen Anstieg der Expressionskonzentrationen von Genen, die an Apoptose, Entzündungen und am Fortschreiten der Leberverletzung beteiligt sind. Diffuse Degeneration von Hepatozyten und Infiltration von Immunzellen wurde durch histologische Auswertung beobachtet. Die Reversibilität von ALF wurde durch die Wiederherstellung des Überlebens- und Serumspiegels von ALT, AST und ALP nach intrasplenischer Transplantation syngenischer gesunder Rattenhepatozyten bestätigt. Dieses Modell stellt eine zuverlässige Alternative zu den verfügbaren ALF-Tiermodellen dar, um die Pathophysiologie von ALF zu untersuchen und das Potenzial einer neuartigen Therapie für ALF zu bewerten. Die Verwendung von zwei verschiedenen Ansätzen ermöglicht es auch, die kombinierte Wirkung von körperlichen und drogeninduzierten Leberverletzungen zu untersuchen. Die Reproduzierbarkeit und Durchführbarkeit des laufenden Verfahrens ist ein zusätzlicher Vorteil des Modells.
Introduction
Akutes Leberversagen (ALF) wird von der American Association for the Study of Liver Diseases als schnelle Entwicklung akuter Leberschäden ohne vorherige Anzeichen von Schäden definiert und ist durch eine schwere Beeinträchtigung der synthetischen, metabolischen und entgiftenden Funktionen der Leber gekennzeichnet1. ALF unterscheidet sich von chronischem Leberversagen, bei dem das Versagen als Folge von Leberschäden über einen langen Zeitraum verursacht und von akutem chronischem Leberversagen (ACLF), wo abrupte Leberschäden als Folge von chronischen Lebererkrankungen2,3,4. Die einzige verfügbare Heilung für ALF ist orthotopische Lebertransplantation (OLT), oder der Tod kann auftreten. Aufgrund des Mangels an Leberspendern ist die Sterblichkeitsrate bei Patienten mit ALF sehr hoch.
Um das Potenzial alternativer therapietherapeutischer Ansätze zu untersuchen und die Pathophysiologie von ALF besser zu verstehen, sind Tiermodelle erforderlich, die die ALF beim Menschen widerspiegeln können. Viele der bereits verfügbaren ALF-Tiermodelle weisen einige Mängel auf. Acetaminophen (APAP) Effekte sind schwer zu reproduzieren, haben aber die engsten Ähnlichkeiten in Bezug auf zeitliche, klinische, biochemische und pathologische Parameter. APAP-induzierte Tiermodelle stoßen häufig auf Probleme aufgrund des Vorhandenseins von Methemoglobinämie, die durch die Oxidation von Hämoglobin durch APAP und seine Zwischenprodukte5,6,7verursacht wird. Ein weiteres Problem ist die mangelnde Reproduzierbarkeit, die sich in unvorhersehbaren Dosisreaktionen und dem Zeitpunkt des Todes widerspiegelt. Die ALF-Tiermodelle, die mit Tetrachlorkohlenstoff (CCl4) hergestellt wurden, haben eine schlechte Reproduzierbarkeit8,9,10,11. Concavalin A (Con A) und Lipoplysaccharid (LPS)-induzierte ALF-Tiermodelle spiegeln nicht das klinische Muster der menschlichen Krankheit wider, obwohl sie Vorteile in der Untersuchung von zellulären Mechanismen haben, die an Autoimmunlebererkrankungen beteiligt sind, und in der Studie von Sepsis bzw.12,13,14,15. In ähnlicher Weise erfordert Thioacetamid (TAA) auch eine Biotransformation zu einem aktiven Metaboliten Thioacetamidsulfoxid und zeigt Artenvariation16,17,18,19. D-Galactosamin (D-Gal) produziert einige biochemische, metabolische und physiologische Veränderungen ähnlich ALF, ist aber nicht in der Lage, den gesamten alf pathologischen Zustand20,21,22,23widerzuspiegeln. Es gab nur sehr wenige Versuche, zwei oder mehr dieser Methoden zu kombinieren, um ein ALF-Modell zu entwickeln, das in der Lage ist, das ALF-Syndrom besser widerzuspiegeln13. Daher sind weitere Studien erforderlich, um ein Modell zu entwickeln, das die Krankheitsparameter widerspiegeln kann, eine bessere Reproduzierbarkeit hat und genügend Zeit bietet, um die Auswirkungen einer therapeutischen Intervention zu untersuchen.
In der aktuellen Studie wurde ein alternatives ALF-Modell bei Ratten durch die Kombination der Wirkungen der partiellen Hepatektomie (PHx) und niedrigeren Dosen eines hepatotoxischen Reagenzes geschaffen. APAP hat eine etablierte Rolle bei der Entstehung von Leberschäden5,24,25. Es ist ein weit verbreitetes Schmerzmittel und ist toxisch für die Leber in supratherapeutischen Dosen durch die Bildung von toxischen Metaboliten. APAP ist die Ursache für viele Todesfälle in den Industrieländern. Körperliche Verletzungen durch partielle Hepatektomie initiieren Aktivierung verschiedener Prozesse bei Entzündungen sowie Leberregeneration. Die Injektion des hepatotoxischen Mittels APAP verursacht eine feindliche Umgebung in der Leber und verhindert die Proliferation von Hepatozyten. Dies reduziert die Belastungszeit für das Tier, was in Kombination mit kleineren Dosen von Hepatotoxin zu einer besseren Reproduzierbarkeit des Verfahrens führt. Daher wurde mit diesem Modell eine kombinatorische Wirkung von zwei Arten von Leberverletzungen untersucht. Um das entwickelte ALF-Tiermodell zu charakterisieren, wurden physiologische und biochemische Parameter untersucht. Die erfolgreiche Reversibilität von ALF wurde durch die Transplantation syngenischer gesunder Rattenhepatozyten bestätigt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Entwicklung eines geeigneten Tiermodells für ALF ist für ein besseres Verständnis der Pathogenese und des Fortschreitens von ALF von größter Bedeutung. Ein gut charakterisiertes ALF-Tiermodell bietet auch die Möglichkeit, neue therapeutische Ansätze gegen ALF zu entwickeln und zu erproben. Es wurden viele Versuche unternommen, ein klinisch relevantes Modell von ALF6,12,21,23,</s…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch den Kernzuschuss des Department of Biotechnology, Government of India an das National Institute of Immunology, Neu-Delhi, unterstützt.
Materials
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Betadine (Povidon-Iodine Solution) | Win-Medicare; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Biological safety cabinet (Class I) | Kartos international; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Cefotaxime (Taxim®) | AlKem; India | cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Cell Strainer | Sigma; US | CLS431752 | |
| Collagenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| DPX Mountant | Sigma; US | 6522 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma; US | HT110132 | |
| Forceps | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Hair removing cream (Veet®) | Reckitt Benckiser, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma; US | MHS16 | |
| Heparin sodium salt | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase From Sheep Testes | Sigma; US | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insulin Syringes | BD; US | REF 303060 | |
| Isoflurane (Forane®) | Asecia Queenborough | No B506 | Inhalation Anaesthetic |
| Ketamine (Ketamax®) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Meloxicam (Melonex®) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian; England | BS-13-8 | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian; England | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Nylon Thread | Mighty; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll® | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | No specific Catalog Number |
| RPMI | Himedia; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scissors | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation; US | No specific Catalog Number | |
| Sucrose | Sigma; US | S0389 | |
| Surgical Blade No. 22 | La Medcare, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical Board | Locally made | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical White Tape | 3M India; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Sutures | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Syringes (1ml, 26 G) | Dispo Van; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Trimmer (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weighing Machine | Braun | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin®) | Indian Immunologicals Limited | Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant |
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