Summary

Geração de um modelo de rato de insuficiência hepática aguda, combinando 70% hepatectomia parcial e paracetamol

Published: November 27, 2019
doi:

Summary

O modelo animal da falha de fígado aguda desenvolvido no estudo atual apresenta uma alternativa praticável para o estudo de terapias potenciais. O modelo atual emprega o efeito combinado de ferimento hepático físico e droga-induzido e fornece uma janela de tempo apropriada para estudar o potencial de terapias novas.

Abstract

A insuficiência hepática aguda (ALF) é uma condição clínica causada por várias etiologias, resultando na perda de funções metabólicas, bioquímicas, sintetizantes e desintoxicantes do fígado. Na maioria dos casos irreversíveis de danos hepáticos, o transplante de fígado ortotrópico (OLT) continua sendo o único tratamento disponível. Para estudar o potencial terapêutico de um tratamento para ALF, seu teste prévio em um modelo animal de ALF é essencial. No presente estudo, um modelo ALF em ratos foi desenvolvido apartir da combinação de hepatectomia parcial de 70% (PHx) e injeções de paracetamol (APAP) que fornece uma janela terapêutica de 48 h. Os lobos laterais medianos e esquerdos do fígado foram removidos para extirpar 70% da massa do fígado e O APAP foi dado 24 h postsurgically por 2 dias. A sobrevivência em animais induzidos por ALF foi encontrada para ser diminuída severamente. O desenvolvimento da ALF foi confirmado por níveis alterados de soro das enzimas alanina amino transferase (ALT), aspartate amino transferase (AST), fósforo alcalino (ALP); mudanças no tempo de protrombina (PT); e avaliação do rácio normalizado internacional (INR). Estudo do perfil de expressão gênica por qPCR revelou um aumento nos níveis de expressão de genes envolvidos na apoptose, inflamação e na progressão da lesão hepática. A degeneração difusa de hepatócitos e a infiltração de células imunes foram observadas pela avaliação histológica. A reversibilidade da ALF foi confirmada pela restauração dos níveis de sobrevivência e soro de ALT, AST e ALP após transplante intrasplenic de hepatócitos de ratos saudáveis singênicos. Este modelo apresenta uma alternativa confiável para os modelos animais ALF disponíveis para estudar a fisiopatologia da ALF, bem como para avaliar o potencial de uma nova terapia para ALF. O uso de duas abordagens diferentes também permite estudar o efeito combinado da lesão hepática induzida por drogas e drogas. A reprodutibilidade e viabilidade do procedimento atual são um benefício adicional do modelo.

Introduction

A insuficiência hepática aguda (ALF) é definida pela Associação Americana para o Estudo de Doenças Hepáticas como o rápido desenvolvimento de lesão hepática aguda sem quaisquer sinais prévios de dano e é caracterizada por comprometimento grave das funções sintéticas, metabólicas e desintoxicantes do fígado1. ALF difere da insuficiência hepática crônica, onde a falha ocorre como resultado de lesão hepática causada durante um longo período de tempo e de insuficiência hepática crônica aguda (ACLF), onde danos bruscos abruptos ocorre como resultado de doenças hepáticas crônicas2,3,4. A única cura disponível para ALF é o transplante de fígado ortotópico (OLT), ou a morte pode ocorrer. Devido à escassez de doadores de fígado, a taxa de mortalidade em pacientes que sofrem de ALF é muito alta.

Para estudar o potencial de abordagens terapêuticas alternativas e para entender melhor a fisiopatologia da ALF, são necessários modelos animais que possam refletir a ALF que ocorre em seres humanos. Muitos dos modelos animais ALF já disponíveis têm várias deficiências. Os efeitos do paracetamol (APAP) são difíceis de reproduzir, mas têm as semelhanças mais próximas em termos de parâmetros temporais, clínicos, bioquímicos e patológicos. Modelos animais induzidos por APAP freqüentemente encontram problemas devido à presença de methemoglobinemia causada pela oxidação da hemoglobina pela APAP e seus intermediários5,6,7. Outro problema é a falta de reprodutibilidade refletida por respostas de dose imprevisíveis e a hora da morte. Os modelos animais ALF produzidos com cloreto de tetra carbono (CCl4)têm baixa reprodutibilidade8,9,10,11. Concavalin A (Con A) e lipoplysaccharide (LPS) induzida a modelos animais ALF não refletem o padrão clínico da doença humana, embora tenham vantagens no estudo de mecanismos celulares envolvidos em doenças hepáticas auto-imunes e no estudo da sepse respectivamente12,13,14,15. Da mesma forma, o thioacetamide (TAA) também requer biotransformação para um metabolito ativo tiaacetamide sulfoxida e mostra variação de espécies16,17,18,19. D-galactosamina (D-Gal) produz algumas alterações bioquímicas, metabólicas e fisiológicas semelhantes a ALF, mas não é capaz de refletir toda a condição patológica ALF20,21,22,23. Houve muito poucas tentativas de combinar dois ou mais desses métodos para desenvolver um modelo ALF que é capaz de refletir a síndrome de ALF de uma maneira melhor13. Portanto, mais estudos são necessários para desenvolver um modelo que possa refletir os parâmetros da doença, tenha melhor reprodutibilidade e proporcione tempo suficiente para estudar os efeitos de uma intervenção terapêutica.

No estudo atual, um modelo alternativo de ALF nos ratos foi criado combinando os efeitos da hepatectomia parcial (PHx) e doses mais baixas de um reagente hepatotoxic. APAP tem um papel bem estabelecido na causa de lesão hepática5,24,25. É um analgésico amplamente utilizado e é tóxico para o fígado em doses supraterapêuticas, formando metabólitos tóxicos. A APAP é a causa de muitas mortes em países desenvolvidos. Lesão física causada pela hepatectomia parcial inicia ativação de vários processos envolvidos na inflamação, bem como regeneração hepática. A injeção do agente hepatotóxico APAP causa um ambiente hostil no fígado, impedindo a proliferação de hepatócitos. Isso reduz o período de estresse sobre o animal, que quando combinado com doses menores de hepatotoxina, leva a uma melhor reprodutibilidade do procedimento. Portanto, usando este modelo, um efeito combinatório de dois tipos de lesões hepáticas tem sido estudado. Para caracterizar o modelo animal alf desenvolvido, parâmetros fisiológicos e bioquímicos têm sido estudados. A reversibilidade bem sucedida da ALF foi confirmada pelo transplante de hepatócitos de ratos saudáveis singênicos.

Protocol

O procedimento descrito abaixo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Ética Animal do Instituto Nacional de Imunologia, Nova Deli. O número de referência em série da aprovação é o IAEC#355/14. 1. Preparação Prepare-se para o procedimento cirúrgico, como descrito anteriormente por Das B et al.26. Use 6-8 semanas de idade ratos Wistar consanguíneos com um peso corporal de 200-250 g. Abrigar os animais em condições padrão de …

Representative Results

Percentual de sobrevivência em modelos animais de ALFA dose ideal de APAP para causar ALF em combinação com 70% PHx foi padronizado como 750 mg / kg de peso corporal. O regime de tratamento começou 24 h após 70% de PHx, quando os animais se recuperaram completamente da cirurgia, e consistiu em duas doses de APAP em intervalos de 24 h. A mortalidade foi observada à taxa de 80% após a administração da segunda dose de APAP, 48 h pós-cirurgia. A porcentagem de sobrevivência foi analisada e tra…

Discussion

O desenvolvimento de um modelo animal adequado para ALF é fundamental para uma melhor compreensão da patogênese e progressão da ALF. Um modelo animal alf bem caracterizado também oferece a oportunidade para o desenvolvimento e julgamento de novas abordagens terapêuticas contra a ALF. Muitas tentativas foram feitas para desenvolver um modelo clinicamente relevante de ALF6,12,21,23,</s…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela concessão principal recebida do Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia para o Instituto Nacional de Imunologia, Nova Deli.

Materials

Acetaminophen (Biocetamol) EG Pharmaceuticals No specific Catalog Number (Local Procurement)
Alkaline Phosphatase Kit (DEA) Coral Clinical System, India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Automated analyser Tulip, Alto Santracruz, India Screen Maaster 3000 Biochemical analyser for liver functional test
Betadine (Povidon-Iodine Solution) Win-Medicare; India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Biological safety cabinet (Class I) Kartos international; India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Bright Field Microscope Olympus, Japan LX51
Cefotaxime (Taxim®) AlKem; India cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement)
Cell Strainer Sigma; US CLS431752
Collagenase Type I Gibco by Life Technologies 17100-017
Cotton Buds Pure Swabs Pvt Ltd; India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Drape Sheet JSD Surgicals, Delhi, India No specific Catalog Number (Local Procurement)
DPX Mountant Sigma; US 6522
Eosin Y solution, alcoholic Sigma; US HT110132
Forceps Major Surgicals; India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Gas Anesthesia System Ugo Basile; Italy 211000
Glucose Himedia, India GRM077
Hair removing cream (Veet®) Reckitt Benckiser, India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Hematoxylin Solution, Mayer's Sigma; US MHS16
Heparin sodium salt Himedia; India RM554
Hyaluronidase From Sheep Testes Sigma; US H6254
I.V. Cannula (Plusflon) Mediplus, India Ref 1732411420
Insulin Syringes BD; US REF 303060
Isoflurane (Forane®) Asecia Queenborough No B506 Inhalation Anaesthetic
Ketamine (Ketamax®) Troikaa Pharmaceuticals Ltd. Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement)
Meloxicam (Melonex®) Intas Pharmaceuticals Ltd; India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Micro needle holders straight &
curved
Mercian; England BS-13-8
Micro needle holders straight &
curved
Mercian; England BS-13-8
Microtome Histo-Line Laboratories, Italy MRS3500
Nylon Thread Mighty; India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Paraformaldehyde Himedia; India GRM 3660
Percoll® GE Healthcare 17-0891-01
Refresh Tears/Eyemist Gel Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India P3060 No specific Catalog Number
RPMI Himedia; India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Scalpel Major Surgicals; India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Scissors Major Surgicals; India No specific Catalog Number (Local Procurement)
SGOT (ASAT) KIT Coral Clinical System, India No specific Catalog Number (Local Procurement)
SGPT (ALAT) KIT Coral Clinical System, India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Shandon Cryotome E Cryostat Thermo Electron Corporation; US No specific Catalog Number
Sucrose Sigma; US S0389
Surgical Blade No. 22 La Medcare, India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Surgical Board Locally made No specific Catalog Number (Local Procurement)
Surgical White Tape 3M India; India 1530-1 Micropore Surgical Tape
Sutures Ethicon, Johnson & Johnson, India NW 5047
Syringes (1ml, 26 G) Dispo Van; India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Trimmer (Clipper) Philips NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005
Weighing Machine Braun No specific Catalog Number (Local Procurement)
William's E Media Himedia; India AT125
Xylazine (Xylaxin®) Indian Immunologicals Limited Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant

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Citar este artículo
Sahay, P., Jain, K., Sinha, P., Das, B., Mishra, A., Kesarwani, A., Sahu, P., Mohan, K. V., Kumar, M. M., Nagarajan, P., Upadhyay, P. Generation of a Rat Model of Acute Liver Failure by Combining 70% Partial Hepatectomy and Acetaminophen. J. Vis. Exp. (153), e60146, doi:10.3791/60146 (2019).

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