Поколение Крысиной модели острой печеночной недостаточности путем объединения 70% частичная гепатэктомия и ацетаминофен
Summary
Острая печеночная недостаточность животных модель, разработанная в текущем исследовании представляет собой осуществимую альтернативу для изучения потенциальных методов лечения. Нынешняя модель использует комбинированный эффект физической и наркотической травмы и обеспечивает подходящее временное окно для изучения потенциала новых методов лечения.
Abstract
Острая печеночная недостаточность (ALF) является клиническим заболеванием, вызванным различными этиологиями, приводящим к потере метаболических, биохимических, синтезирующих и детоксикационных функций печени. В большинстве случаев необратимые повреждения печени, ортотропическая пересадка печени (OLT) остается единственным доступным лечением. Для изучения терапевтического потенциала лечения ALF, его предварительное тестирование в животной модели ALF имеет важное значение. В текущем исследовании, модель ALF у крыс была разработана путем объединения 70% частичной гепатэктомии (PHx) и инъекций ацетаминофен (APAP), который обеспечивает терапевтическое окно 48 ч. Средние и левые боковые доли печени были удалены до акцизного 70% массы печени и APAP был дан 24 ч после хирургического в течение 2 дней. Было установлено, что выживаемость животных, вызванных АЛФ, сильно снизилась. Развитие ALF было подтверждено измененным уровнем сыворотки ферментов аланина аминотрансферозы (ALT), аспартатами амино-трансферазы (АСТ), щелочной фосфатазой (ALP); изменения протромбина времени (PT); и оценка международного нормализованного коэффициента (INR). Изучение профиля экспрессии генов qPCR выявило увеличение уровня экспрессии генов, участвующих в апоптозе, воспалении и прогрессировании травмы печени. Диффузная дегенерация гепатоцитов и инфильтрация иммунных клеток наблюдалась гистологическая оценка. Реверсивность ALF была подтверждена восстановлением уровня выживания и сыворотки АЛТ, АСТ и ALP после интраспельной трансплантации сингенных здоровых крысиных гепатоцитов. Эта модель представляет собой надежную альтернативу имеющимся МОделям животных ALF для изучения патофизиологии ALF, а также для оценки потенциала новой терапии для ALF. Использование двух различных подходов также позволяет изучить комбинированный эффект физической и медикаментозной травмы печени. Воспроизводимость и осуществимость текущей процедуры является дополнительным преимуществом модели.
Introduction
Острая печеночная недостаточность (ALF) определяется Американской ассоциацией по изучению заболеваний печени как быстрое развитие острой травмы печени без каких-либо предварительных признаков повреждения и характеризуется тяжелыми нарушениями синтетических, метаболических и детоксикационных функций печени1. ALF отличается от хронической печеночной недостаточности, где отказ происходит в результате травмы печени, вызванной в течение длительного периода времени и от острой хронической печеночной недостаточности (ACLF), где резкое повреждение печени происходит в результате хронических заболеваний печени2,3,4. Единственным доступным лекарством для ALF является ортотопическая пересадка печени (OLT), или смерть может произойти. Из-за нехватки доноров печени, уровень смертности у пациентов, страдающих от ALF очень высока.
Для изучения потенциала альтернативных терапевтических подходов и лучше гораздо лучше понять патофизиологию ALF необходимы модели животных, которые могут отражать ALF, происходящие в человеческих существах. Многие из уже имеющихся моделей животных ALF имеют ряд недостатков. Эффекты ацетаминофена (APAP) трудно поддаются размножению, но имеют самое близкое сходство с точки зрения временных, клинических, биохимических и патологических параметров. APAP-индуцированных животных модели часто сталкиваются с проблемами из-за присутствия метемоглобинемии, вызванной окислением гемоглобина APAP и его промежуточных5,6,7. Еще одной проблемой является отсутствие воспроизводимости, отражаемые непредсказуемыми ответами на дозу и временем смерти. Модели животных ALF, произведенные с использованием углеродного тетрахлорида (CCl4) имеют плохую воспроизводимость8,9,10,11. Модели животных ALF, индуцированные ALF, не отражают клиническую структуру заболевания человека, хотя и имеют преимущества в изучении клеточных механизмов, участвующих в аутоиммунных заболеваниях печени и в изучении сепсиса соответственно12,13,14,15. Аналогичным образом, тиоацетамид (TAA) также требует биотрансформации к активному метаболиту тиоацетамида сульфоксида и показывает видовые изменения16,17,18,19. D-галактозамин (D-Gal) производит некоторые биохимические, метаболические и физиологические изменения, аналогичные ALF, но не в состоянии отразить все патологическое состояние ALF20,21,22,23. Там было очень мало попыток объединить два или более из этих методов для разработки модели ALF, которая способна отражать синдром ALF в лучшем виде13. Поэтому необходимы дальнейшие исследования для разработки модели, которая может отражать параметры заболевания, имеет лучшую воспроизводимость и предоставляет достаточно времени для изучения последствий терапевтического вмешательства.
В текущем исследовании, альтернативная модель ALF у крыс была создана путем объединения эффектов частичной гепатэктомии (PHx) и более низкие дозы гепатотоксического реагента. APAP имеет хорошо зарекомендовавшую себя роль в причинении травмы печени5,24,25. Это широко используется обезболивающее и является токсичным для печени в супратерапевтических дозах путем формирования токсичных метаболитов. АПАП является причиной многих смертей в развитых странах. Физические повреждения, вызванные частичной гепатэктомии инициирует активацию различных процессов, участвующих в воспалении, а также регенерации печени. Инъекция гепатотоксического агента APAP вызывает враждебную среду в печени, предотвращая распространение гепатоцитов. Это уменьшает период стресса на животное, что в сочетании с меньшими дозами гепатотоксина, приводит к лучшей воспроизводимости процедуры. Поэтому, используя эту модель, был изучен комбинированный эффект двух типов травм печени. Для характеристики разработанной модели ЖИВОТНЫх ALF были изучены физиологические и биохимические параметры. Успешная обратимость ALF была подтверждена трансплантацией сингенных здоровых крысиных гепатоцитов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Развитие соответствующей модели животных для ALF имеет первостепенное значение для лучшего понимания патогенеза и прогрессирования ALF. Хорошо характеризуется ALF животных модель также предоставляет возможность для разработки и испытания новых терапевтических подходов против ALF. Было п…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана основным грантом, полученным от Департамента биотехнологии, правительства Индии Национальному институту иммунологии, Нью-Дели.
Materials
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Betadine (Povidon-Iodine Solution) | Win-Medicare; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Biological safety cabinet (Class I) | Kartos international; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Cefotaxime (Taxim®) | AlKem; India | cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Cell Strainer | Sigma; US | CLS431752 | |
| Collagenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| DPX Mountant | Sigma; US | 6522 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma; US | HT110132 | |
| Forceps | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Hair removing cream (Veet®) | Reckitt Benckiser, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma; US | MHS16 | |
| Heparin sodium salt | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase From Sheep Testes | Sigma; US | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insulin Syringes | BD; US | REF 303060 | |
| Isoflurane (Forane®) | Asecia Queenborough | No B506 | Inhalation Anaesthetic |
| Ketamine (Ketamax®) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Meloxicam (Melonex®) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian; England | BS-13-8 | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian; England | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Nylon Thread | Mighty; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll® | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | No specific Catalog Number |
| RPMI | Himedia; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scissors | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation; US | No specific Catalog Number | |
| Sucrose | Sigma; US | S0389 | |
| Surgical Blade No. 22 | La Medcare, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical Board | Locally made | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical White Tape | 3M India; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Sutures | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Syringes (1ml, 26 G) | Dispo Van; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Trimmer (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weighing Machine | Braun | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin®) | Indian Immunologicals Limited | Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant |
Referencias
- Polson, J., Lee, W. M. AASLD position paper: the management of acute liver failure. Hepatology. 41, 1179-1197 (2005).
- Chung, R. T., et al. Pathogenesis of liver injury in acute liver failure. Gastroenterology. 143, 1-7 (2012).
- Fyfe, B., Zaldana, F., Liu, C. The Pathology of Acute Liver Failure. Clinical Liver Disease. 22, 257-268 (2018).
- Lefkowitch, J. H. The Pathology of Acute Liver Failure. Advances in Anatomic Pathology. 23, 144-158 (2016).
- Mitchell, J. R., et al. Acetaminophen-induced hepatic necrosis. I. Role of drug metabolism. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 187, 185-194 (1973).
- Rahman, T. M., Hodgson, H. J. Animal models of acute hepatic failure. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 81, 145-157 (2000).
- Rahman, T. M., Selden, A. C., Hodgson, H. J. A novel model of acetaminophen-induced acute hepatic failure in rabbits. Journal of Surgical Research. 106, 264-272 (2002).
- Dashti, H., et al. Thioacetamide- and carbon tetrachloride-induced liver cirrhosis. European Surgical Research. 21, 83-91 (1989).
- Demirdag, K., et al. Role of L-carnitine in the prevention of acute liver damage-induced by carbon tetrachloride in rats. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 19, 333-338 (2004).
- Sheweita, S. A., Abd El-Gabar, M., Bastawy, M. Carbon tetrachloride-induced changes in the activity of phase II drug-metabolizing enzyme in the liver of male rats: role of antioxidants. Toxicology. 165, 217-224 (2001).
- Sinicrope, R. A., Gordon, J. A., Little, J. R., Schoolwerth, A. C. Carbon tetrachloride nephrotoxicity: a reassessment of pathophysiology based upon the urinary diagnostic indices. American Journal of Kidney Diseases. 3, 362-365 (1984).
- Takada, Y., Ishiguro, S., Fukunaga, K. Large-animal models of fulminant hepatic failure. Journal of Artificial Organs. 6, 9-13 (2003).
- Takada, Y., et al. Increased intracranial pressure in a porcine model of fulminant hepatic failure using amatoxin and endotoxin. Journal of Hepatology. 34, 825-831 (2001).
- Leist, M., Wendel, A. A novel mechanism of murine hepatocyte death inducible by concanavalin A. Journal of Hepatology. 25, 948-959 (1996).
- Mizuhara, H., et al. Strain difference in the induction of T-cell activation-associated, interferon gamma-dependent hepatic injury in mice. Hepatology. 27, 513-519 (1998).
- Bruck, R., et al. Hypothyroidism minimizes liver damage and improves survival in rats with thioacetamide-induced fulminant hepatic failure. Hepatology. 27, 1013-1020 (1998).
- Chieli, E., Malvaldi, G. Role of the microsomal FAD-containing monooxygenase in the liver toxicity of thioacetamide S-oxide. Toxicology. 31, 41-52 (1984).
- Fontana, L., et al. Serum amino acid changes in rats with thioacetamide-induced liver cirrhosis. Toxicology. 106, 197-206 (1996).
- Peeling, J., et al. Cerebral metabolic and histological effects of thioacetamide-induced liver failure. American Journal of Physiology. 265, 572-578 (1993).
- Blitzer, B. L., et al. A model of fulminant hepatic failure in the rabbit. Gastroenterology. 74, 664-671 (1978).
- Diaz-Buxo, J. A., Blumenthal, S., Hayes, D., Gores, P., Gordon, B. Galactosamine-induced fulminant hepatic necrosis in unanesthetized canines. Hepatology. 25, 950-957 (1997).
- Maezono, K., Mawatari, K., Kajiwara, K., Shinkai, A., Maki, T. Effect of alanine on D-galactosamine-induced acute liver failure in rats. Hepatology. 24, 1211-1216 (1996).
- Patzer, J. F., et al. D-galactosamine based canine acute liver failure model. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 1, 354-367 (2002).
- Newsome, P. N., Plevris, J. N., Nelson, L. J., Hayes, P. C. Animal models of fulminant hepatic failure: a critical evaluation. Liver Transplantation. 6, 21-31 (2000).
- Yoon, E., Babar, A., Choudhary, M., Kutner, M., Pyrsopoulos, N. Acetaminophen-Induced Hepatotoxicity: a Comprehensive Update. Journal of Clinical and Translational Hepatology. 4, 131-142 (2016).
- Das, B., et al. Intrasplenic Transplantation of Hepatocytes After Partial Hepatectomy in NOD.SCID Mice. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nature Protocols. 3, 1167-1170 (2008).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43, 506-520 (1969).
- Fry, J. R., Jones, C. A., Wiebkin, P., Bellemann, P., Bridges, J. W. The enzymic isolation of adult rat hepatocytes in a functional and viable state. Analytical Biochemistry. 71, 341-350 (1976).
- Green, C. J., et al. The isolation of primary hepatocytes from human tissue: optimising the use of small non-encapsulated liver resection surplus. Cell Tissue Bank. 18, 597-604 (2017).
- Ismail, T., et al. Growth of normal human hepatocytes in primary culture: effect of hormones and growth factors on DNA synthesis. Hepatology. 14, 1076-1082 (1991).
- Greenfield, E. A. Sampling and Preparation of Mouse and Rat Serum. Cold Spring Harbor Protocols. 11, (2017).
- Walsh, K. M., Timms, P., Campbell, S., MacSween, R. N., Morris, A. J. Plasma levels of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and tissue inhibitors of metalloproteinases -1 and -2 (TIMP-1 and TIMP-2) as noninvasive markers of liver disease in chronic hepatitis C: comparison using ROC analysis. Digestive Diseases and Sciences. 44, 624-630 (1999).
- Thiele, N. D., et al. TIMP-1 is upregulated, but not essential in hepatic fibrogenesis and carcinogenesis in mice. Scientific Reports. 7, 714 (2017).
- Li, C. P., Li, J. H., He, S. Y., Li, P., Zhong, X. L. Roles of Fas/Fasl, Bcl-2/Bax, and Caspase-8 in rat nonalcoholic fatty liver disease pathogenesis. Genetics and Molecular Research. 13, 3991-3999 (2014).
- Kim, W. R., Flamm, S. L., Di Bisceglie, A. M., Bodenheimer, H. C. Serum activity of alanine aminotransferase (ALT) as an indicator of health and disease. Hepatology. 47, 1363-1370 (2008).
- Henry, L. Serum transaminase levels in liver disease. Journal of Clinical Pathology. 12, 131-137 (1959).
- Giannini, E. G., Testa, R., Savarino, V. Liver enzyme alteration: a guide for clinicians. Canadian Medical Association Journal. 172, 367-379 (2005).
- Hammam, O., et al. The role of fas/fas ligand system in the pathogenesis of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Hepatitis Monthly. 12, 6132 (2012).
- Prystupa, A., et al. Activity of MMP-2, MMP-8 and MMP-9 in serum as a marker of progression of alcoholic liver disease in people from Lublin Region, eastern Poland. The Annals of Agricultural and Environmental Medicine. 22, 325-328 (2015).
- Sekiyama, K. D., Yoshiba, M., Thomson, A. W. Circulating proinflammatory cytokines (IL-1 beta, TNF-alpha, and IL-6) and IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra) in fulminant hepatic failure and acute hepatitis. Clinical and Experimental Immunology. 98, 71-77 (1994).
- Schwabe, R. F., Brenner, D. A. Mechanisms of Liver Injury. I. TNF-alpha-induced liver injury: role of IKK, JNK, and ROS pathways. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 583-589 (2006).
- Ataseven, H., et al. The levels of ghrelin, leptin, TNF-alpha, and IL-6 in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma due to HBV and HDV infection. Mediators of Inflammation. 2006, 78380 (2006).
- Ambrosino, G., et al. Cytokines and liver failure: modification of TNF- and IL-6 in patients with acute on chronic liver decompensation treated with Molecular Adsorbent Recycling System (MARS). Acta Bio Medica Atenei Parmensis. 74, 7-9 (2003).
- Robert, A., Chazouilleres, O. Prothrombin time in liver failure: time, ratio, activity percentage, or international normalized ratio. Hepatology. 24, 1392-1394 (1996).
- Francavilla, A., et al. A dog model for acetaminophen-induced fulminant hepatic failure. Gastroenterology. 96, 470-478 (1989).
- Terblanche, J., Hickman, R. Animal models of fulminant hepatic failure. Digestive Diseases and Sciences. 36, 770-774 (1991).
- Tunon, M. J., et al. Rabbit hemorrhagic viral disease: characterization of a new animal model of fulminant liver failure. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141, 272-278 (2003).
